张 萍 邢琳琳 阮 昕 宁学聪 巩翠珂 王志华 孙武装

(邢台市人民医院呼吸内科，河北 邢台 054001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要累及肺实质、肺血管及气道〔1〕。目前研究显示炎症反应是COPD发生的主要原因之一，炎症细胞被激活后释放大量炎症因子浸润肺组织、气道甚至全身机体，进一步参与COPD的发生发展〔2〕。血管活性物质血管紧张素(Ang)Ⅱ是一种重要的血管及气道收缩因子，AngⅡ在COPD过程中大量分泌并释放，导致肺组织进一步损伤〔3〕。有研究表明AngⅡ能活化受体型的酪氨酸激酶，还能够激活血小板，诱导TXA2表达，促进炎症因子释放，对靶组织等造成损伤〔4，5〕，AngⅡ可能对COPD的炎症反应起重要作用。本研究旨在探讨AngⅡ在COPD中的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 50只(200±20)g的SD雄性大鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证书：SCXK(沪)2012-0002，大鼠自由饮食和摄水。

1.2主要试剂及仪器 氯沙坦钾片，规格：50 mg，浙江华海药业股份有限公司；脂多糖(LPS)购自北京索莱宝生物技术有限公司；兔抗JAK2，信号转导与转录激活因子(STAT)3，p-STAT3及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体均购自美国Abcam公司；白细胞介素(IL)-1β、干扰素(IFN)-γ、IL-4、IL-6、IL-10、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP抑制剂(TIMP)-1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；ELX800酶标分析仪购自美国Bio-Tek公司。

1.3建模及分组〔6〕50只大鼠随机分为正常组，模型组，氯沙坦低、中、高剂量组，每组10只。其中模型组及氯沙坦组均采用反复烟熏+气管内两次滴加LPS复制COPD大鼠模型：大鼠置于玻璃烟熏箱内，每天3次，每次30 min，每次间隔6 h，连续28 d，向烟熏箱内注入香烟烟雾。同时在第1、14天，将大鼠麻醉，沿着气管一次性缓慢注入200 μg/ml LPS，体积200 μl。而正常组大鼠照常饲养。在每天烟熏前30 min，氯沙坦组大鼠分别给予灌胃5、10、20 mg·kg-1·d-1氯沙坦，正常组及模型组给予等量生理盐水，连续28 d。

1.4支气管肺泡灌洗液(BALF)及标本的获得 第28天麻醉大鼠，将大鼠右支气管结扎，用生理盐水冲洗大鼠左肺支气管肺泡3次，离心并重悬，灌洗液用于总白细胞数、中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞的计数。另外取右肺组织并剔除脂肪组织，清洗干净血迹，用于细胞因子及蛋白的检测。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 右肺组织标本4%多聚甲醛固定，石蜡包埋并进行切片后，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ，梯度酒精，蒸馏水中脱蜡至水洗。苏木素染色，盐酸酒精分化，流水冲洗。梯度酒精脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性树脂封固，于镜下观察。

1.6ELISA法检测IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-9、TIMP-1含量 取部分右肺组织，匀浆离心后，加入胰蛋白酶裂解，1 500 r/min离心10 min，收集上清液，取上清液严格按照试剂盒说明书检测。

1.7Western印迹检测JAK/STAT信号通路相关蛋白表达 取肺组织标本，匀浆机匀浆后离心，加入细胞裂解液裂解，4℃离心机离心，收集上清液即总蛋白，并测定蛋白浓度。制作5%浓缩胶，12%分离胶，室温水封静置30 min。蛋白变性，取30 ng左右上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，后湿法转膜。一抗溶液(兔抗JAK2、STAT3、p-STATF3及GAPDH多克隆抗体，稀释度均为1∶100)孵育，4℃过夜；次日于二抗溶液室温孵育1 h。于凝胶成像系统中曝光。

1.8统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组肺组织病理形态 正常组肺组织及支气管结构完整，未见异常；模型组肺泡断裂，肺泡间隔变窄，有大量炎性因子浸润；氯沙坦组肺泡结构较为完整，炎性因子浸润减少，肺泡间隔变宽。

2.2各组BALF中各类细胞数目 与正常组比较，模型组中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞总数均显著提高(P<0.01)；与模型组比较，氯沙坦低、中、高剂量组均显著降低(P<0.01)。见表1。

2.3各组肺组织中IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-8含量 与正常组比较，模型组IL-1β、IFN-γ及IL-6含量显著升高，IL-4及IL-10含量显著降低(均P<0.01)。与模型组比较，氯沙坦低、中、高剂量组中IL-1β、IFN-γ及IL-6含量显著降低，IL-4及IL-10含量均显著升高(均P<0.01)。见表2。

2.4各组肺组织MMP-9及TIMP-1含量 与正常组比较，模型组MMP-9含量明显提高，TIMP-1含量明显降低(均P<0.01)；与模型组比较，氯沙坦低、中、高剂量组MMP-9含量明显降低，TIMP-1含量明显提高(均P<0.01)。见表1。

表1 各组BALF中各类细胞数及肺组织MMP-9、TIMP-1含量比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；下表同

表2 各组肺组织中IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-8含量比较

2.5各组肺组织JAK/STAT信号通路指标表达 与正常组(0.11±0.01，0.32±0.03)比较，模型组JAK2及p-STAT3表达量(1.12±0.11，0.45±0.04)明显上调(P<0.01)；与模型组比较，氯沙坦中、高剂量组JAK2表达量(0.42±0.04、0.28±0.03)明显下调(P<0.01)，低剂量组(1.10±0.18)差异无统计学意义(P>0.05)，而低、中、高剂量组p-STAT3表达量(0.38±0.04、0.27±0.03、0.18±0.02)明显下调(均P<0.01)。见图1。

图1 各组肺组织JAK/STAT信号通路指标表达

3 讨 论

研究表明，肺血管收缩反应性增强及肺血管重构所引起的肺循环失衡是COPD发生、发展的重要病理基础，其中COPD所引起的肺血管内皮损伤进而导致的血管收缩及舒张之间的失衡是其主要的表现形式〔3〕。AngⅡ是常见的肺血管及气道收缩因子，COPD或急性肺损伤过程中由于缺血缺氧，酸中毒引起了AngⅡ的大量分泌与释放，加重了肺损伤〔4，5〕。AngⅡ同时还能诱导中性粒细胞等炎性细胞的聚集，进而调控黏附因子、趋化因子、细胞因子等多种炎症介质表达，延长组织的损伤时间，参与机体的炎症反应〔4，5〕。AngⅡ主要通过与AngⅡ受体(1型和2型)结合，发挥其生物学调控作用。因此通过拮抗AngⅡ与AngⅡ受体的结合，或者降低AngⅡ受体含量均能一定程度上遏制AngⅡ的诱导作用。本研究表明氯沙坦对吸烟引起的COPD小鼠肺损伤具有显著的保护作用，但是具体作用机制未知〔7〕。另外研究还发现氯沙坦能够减轻LPS引起的急性SD大鼠肺损伤，与降低细胞间黏附分子(ICAM)-1表达有关〔8〕，提示氯沙坦可能对COPD炎症反应具有抑制作用。

吸烟是目前COPD发生的最为重要的因素之一，烟雾颗粒或有害颗粒致使肺部产生严重的炎症反应。因此通过反复的烟熏及气道滴加LPS成为COPD造模的主要手段，此方法成功率高，且动物肺组织病理变化与人类类似〔6〕。本研究结果表明氯沙坦能显著恢复大鼠肺组织形态，改善肺泡结构，同时还能降低炎症细胞浸润，减少炎症细胞的分泌；氯沙坦能显著抑制百草枯急性染毒大鼠肺组织损伤，减轻炎症细胞浸润，并增加肺泡间厚度。COPD过程中肺泡灌洗液(BALF)中中性粒细胞、单核巨噬细胞、白细胞、淋巴细胞释放大量的促炎因子(IL-1β、IFN-γ、IL-6)，而分泌较少的抗炎因子(IL-4、IL-10)。另外炎症细胞还分泌大量的MMPs(MMP-9)，MMP-9不仅降解了肺细胞外基质，使肺细胞壁变薄，还使细胞分泌大量黏液，同时缩短了肺细胞间隙，又促使中性粒细胞、白细胞等炎症细胞穿过血管向肺细胞进一步的浸润，加重肺组织炎症损伤。而正常生理情况下，MMPs与TIMP以1∶1的比例结合，进而处于动态平衡，保证细胞外基质成分的稳定，而在COPD过程中MMP-9大量分泌的同时，TIMP-1的分泌量大大减少。

另外大量的炎症因子如IL-1β、IL-6等能够激活多种炎症信号通路参与机体的炎症反应，如JAK/STAT信号通路。此信号通路是由酪氨酸激酶JAK和转录因子家族STAT构成，当JAK受体与酪氨酸激酶受体IL-1β、IL-6结合形成二聚体后，JAK激酶被活化后，能够使JAK受体上的酪氨酸残基发生磷酸化，并与周围氨基酸序列形态特定位点，招募含有SH2结构域的STAT蛋白，进而使STAT磷酸化，进入细胞核，促进炎症因子转录，加重COPD炎症反应。同时研究还发现AngⅡ还能激活JAK2/STAT3信号通路，参与高血压、动脉粥样硬化的发生发展〔9，10〕，提示氯沙坦可能与JAK2/STAT3信号通路密切相关。本研究结果表明氯沙坦能显著下调JAK2及p-STAT3表达。

综上，AngⅡ受体拮抗剂氯沙坦能显著改善COPD大鼠肺组织形态，降低炎症细胞浸润，减少炎症细胞分泌，降低促炎因子IL-1β、IFN-γ、IL-6及MMP-9分泌，提高抗炎因子IL-4、IL-10及TIMP-1分泌，进而抑制COPD炎症反应，此过程可能与阻断JAK2/STAT3信号通路有关。