李玉洁 韩倩倩 陈 鑫 徐慧颖 李寒冰 张明昊 赵珍珍

(河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046)

中药地黄为玄参科多年生草本植物地黄的新鲜或干燥块根〔1〕。以地黄为主的复方如：六味地黄、金匮肾气丸均为历代医家用于温补肾阳、延缓衰老的代表方剂〔2～9〕。地黄花为地黄的花蕾，有治消渴，肾虚腰痛等功效，《本草纲目》记载：“地黄花研末服用，功同地黄，如肾虚腰脊疼痛，将其研为末，用酒送服”〔10〕。秀丽隐杆线虫(简称线虫)是存在土壤中的一种低等生物。由于其易于饲养和保存、生长周期较短、繁殖快、进化过程中高度保守、遗传信息清晰，与人类的同源性基因高达60%～80%等优点，使得线虫成为抗衰老药物、功能因子研究的理想模型〔11，12〕。本实验探讨地黄花多糖对线虫寿命的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1一般材料 菌株与试剂大肠杆菌(Escherichia coli)OP50、野生型秀丽隐杆线虫(C.elegans)为中国人民解放军军事医学科学院惠赠；琼脂粉及牛肉蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司；地黄花采自河南焦作；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。实验仪器：MJX-250B-Z电热恒温培养箱上海博迅实业有限公司；SZ51解剖显微镜日本奥林巴斯；vd-850超净工作台江苏苏净集团有限公司；MultiskanFC全波长多功能酶标仪美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方法 将地黄花粉碎，过80目筛，称取50 g，置于1 000 ml圆底烧瓶中，石油醚脱脂，滤渣加500 ml水煎煮2次，合并滤液，常温减压浓缩干燥，将干燥药物配制成35%的水溶解，加95%乙醇，使乙醇终浓度为80%，静置24 h，2 000 r/min离心5 min，下层沉淀物为地黄花粗多糖，干燥后称重，提取率为11.94%。线虫培养采用Brenner〔13〕的方法，将雌雄同体线虫饲养于涂布大肠杆菌OP50(E.coliOP50)的线虫标准培养基(NGM)上，20℃倒置培养。线虫寿命测定于同期化后第4天，挑取大小一致的线虫放入正常或含有3种不同的含药培养基中培养。分为对照组、地黄花多糖低、中、高剂量组(25、50、100 mg/L)，以分组当天记为线虫生命起始第0天，以取虫器末端轻探虫体无反应记为线虫生命终止，从生命起始到终止时间记为线虫寿命期。在线虫寿命期内，每24 h将各平板上线虫转移至相同的新平板中，记录各组线虫存活及死亡数量，依据线虫生存、死亡的条数绘制生存曲线。热应激实验将同期化幼虫置于含或不含药物的NGM板中，每组3个板，每板10条，48 h后，将线虫置于35℃培养箱中观察，每隔1 h记录线虫死亡、存活数目，连续观察12 h，重复2次，死亡标准同寿命实验。氧化应激实验将同期化幼虫置于含或不含药物的NGM板中，每组3个板，每板10条，48 h后，将各组线虫转移到含有0.4 mmol/L过氧化氢(H2O2)的NGM培养基板中观察，每隔1 h记录线虫存活数目，连续观察12 h，重复2次，死亡标准同寿命实验。生殖能力测定参照Onken等〔11〕的方法，每组挑取10条L4期的线虫到含或不含药物的NGM板中，每板放置2条线虫。每隔24 h将线虫转移至新板中，直至线虫生殖能力丧失。所有产卵板于20℃倒置培养24 h，记录幼虫数量，将每天产生的子代数目相加即为线虫终身产卵量。SOD活性检测将同期化幼虫置于含或不含药物的NGM板中，每个平板放入30～35只线虫，每24 h将各平板上线虫转移至相同的新平板中，5 d后收集成虫于EP管中，液氮中反复冻融3次提取线虫蛋白，离心收集上清液，严格按照试剂盒说明书要求操作。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行Kaplan-Meier法、One-Way ANOVA分析及LSD检验。

2 结 果

2.1各组线虫寿命比较 与对照组相比，地黄花多糖低剂量组最大寿命明显延长(P<0.05)，地黄花多糖中剂量组平均寿命及最大寿命均明显延长(P<0.05)，地黄花多糖高剂量平均寿命及最大寿命均无明显变化(P>0.05)，见表1。线虫的生存曲线见图1。

表1 地黄花多糖对线虫寿命的影响

与对照组比较:1)P<0.05

图1 地黄花多糖对线虫生存曲线的影响

2.2各组热应激条件下线虫寿命比较 与对照组〔(7.30±0.29)h〕相比，地黄花多糖低、中、高剂量组平均寿命〔(10.77±0.24)h、(9.12±0.37)h、(8.56±0.39)h〕均显著延长(P<0.01)。生存曲线见图2。

图2 地黄花多糖对热应激条件下线虫生存曲线的影响

2.3各组氧化应激条件下线虫寿命比较 与对照组〔(7.05±0.42)h〕相比，地黄花多糖低、中剂量组平均寿命〔(8.74±0.70)h、(9.79±0.44)h〕极显著延长(P<0.01)；地黄花多糖高剂量组〔(6.68±0.58)h〕与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。生存曲线见图3。

图3 地黄花多糖对氧化应激条件下线虫生存曲线的影响

2.4各组生殖能力比较 与对照组〔(201.75±6.40)个〕相比，地黄花多糖低、中、高剂量组平均产卵数〔(187.53±22.46)个、(175.50±22.17)个、(132.83±11.68)个〕均有下降趋势，其中地黄花多糖高剂量组显著少于对照组(P<0.01)。

2.5各组SOD活性比较 与对照组〔(30.29±2.98)mg/L〕相比，地黄花多糖低、中剂量组SOD活性〔(50.96±4.55)、(49.84±1.83)、(23.49±6.22)mg/L〕显著增强(P<0.05，P<0.01)；地黄花多糖高剂量组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

本文结果发现地黄花多糖低剂量及中剂量均可显著延长线虫的寿命，中剂量效果最好，随着给药剂量的继续增大，作用降低，推测地黄花多糖抗衰老作用量效曲线呈倒“U”形。线虫寿命的延长与压力应激状态下生存率提高具有很高的相关性，应激能力增强是线虫寿命延长的原因之一〔14，15〕。本研究结果发现地黄花多糖各剂量均可显著延长线虫热应激条件下的寿命，提高热应激条件下线虫的存活率。在体内和体外实验中，H2O2能诱导活性氧生成增加，被广泛用作诱导氧化应激模型〔11〕。本实验结果发现地黄花多糖低剂量及中剂量对H2O2诱导的氧化有很强的保护作用，但随着给药剂量的继续增大，作用效果降低，结果与寿命实验结果一致。寿命与许多生理参数如：饮食量和生殖能力等密切相关〔16，17〕。本文结果推测，地黄花多糖发挥抗衰老作用可能与影响生殖能力有一定关系，但并非主要通过降低生殖能力发挥抗衰老作用，有待进一步研究。氧化应激是指机体受到刺激后，机体或细胞内自由基的产生和消除失衡，活性氧在细胞内蓄积，体内活性氧的积聚可造成机体氧化损伤，氧化损伤被认为是导致机体衰老的一个重要因素〔18,19〕。SOD作为体内主要的抗氧化物酶，在清除自由基方面发挥关键性作用〔20〕。本实验结果推断，地黄花多糖可能是通过提高线虫体内SOD酶活性，进而降低体内活性氧水平而发挥抗衰老作用。随着地黄花多糖用药剂量的继续增大，作用效果减弱，并显示出一定副作用，据此推测地黄花多糖抗衰老作用的量效曲线呈倒“U”形，其抗衰老作用的发挥，可能与提高线虫体内SOD酶活性，增强机体应激能力有关。