季坤源，高 慧，董巧香*

(温州医科大学a检验医学院 生命科学学院，b公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035)

纳米颗粒，又称超细粒子，其粒径介于1～100 nm之间，具有宏观材料不具有的许多优异特性，如表面效应、小尺寸效应和量子隧穿效应等[1-2]。随着科技的发展，纳米材料逐渐走入人们生活。纳米二氧化钛是应用最广泛的纳米材料之一，广泛应用于化妆品、纺织品、遮光剂、消毒剂以及运动用品等。研究发现，在暴露纳米二氧化钛的小鼠肝脏、肺、脑可以检测到纳米颗粒的存在。

随着纳米材料应用的普及，近年来它的安全性也受到普遍关注[3]。纳米二氧化钛可通过呼吸道达到肺泡末端，诱发肺的氧化应激、炎症反应，长期会造成肺的纤维化[4]，同时纳米二氧化钛可进入血液[5-6]，影响大脑功能[7]，造成肝脏损伤[8]等。研究发现，与柴油机尾气中的颗粒物和炭黑等纳米粒子相比，纳米二氧化钛对睾丸间质细胞有更强的毒性。纳米二氧化钛可透过雄性小鼠血睾屏障，导致雄性小鼠的体重增长率、精子质量与活性远低于对照组[9]。青春期雄性小鼠暴露于不同浓度的纳米二氧化钛，成年后采集血清与睾丸进行相关指标检测发现，纳米二氧化钛的浓度越高，小鼠血清睾酮的含量越低，睾丸组织学改变程度越大[10]。Gao等[11]研究发现，纳米二氧化钛可显著降低雌性小鼠血清雌激素的含量，小鼠卵巢功能下降。纳米二氧化钛可能通过影响性激素水平或性激素信号通路，从而影响睾丸和卵巢[10-11]。

本研究采用C57BL/6-GFP品系的雌性小鼠为模型，研究纳米二氧化钛暴露对青春期小鼠乳腺发育影响。通过对乳腺的异常变化分析纳米二氧化钛在乳腺病变发展过程中的作用，为探究纳米二氧化钛作为环境污染物的作用机制提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级C57BL/6-GFP小鼠引种于南京医科大学，现本实验室可自行繁殖。小鼠饲养过程严格按照温州医科大学动物管理中心实验动物规则饲养。笼具、饮用水及饲料中均不含纳米二氧化钛，可以排除外界环境因素对实验的干扰。

1.1.2 仪器与试剂

动物麻醉系统，美国Microflex公司；石蜡切片机，德国Leica公司；光学显微镜及解剖显微镜，日本尼康公司。

纳米二氧化钛粉末(5 nm)，碧云天公司；苏木精、伊红，美国Sigma公司；Ki67抗体，美国Thermo公司；ERα抗体，美国Santa公司；酒精、福尔马林、二甲苯溶液和封片剂，美国Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理

将3周龄雌性小鼠随机分为3组，每组5只，分别为对照组(超纯水)、纳米二氧化钛低剂量处理组(50 mg·kg-1)和纳米二氧化钛高剂量处理组(250 mg·kg-1)，在相同的时间点每天灌胃1次，持续28 d。第29 d小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，并记录体重。取出小鼠的肝脏和子宫，称重并拍照。取出小鼠乳腺，腹股沟处乳腺用于组织整体染色(WM染色)，胸腺处乳腺固定于福尔马林溶液中，采用常规石蜡包埋。

1.2.2 乳腺组织学定量分析

乳腺导管进行病理学切片和HE染色，观察到导管的4种形态，即正常的双层细胞结构为主的乳腺导管、多个细胞层增生性病变的导管、非典型腺管增生的导管和发生原位癌的导管。显微镜下对以上乳腺导管形态分别进行观察计数，计算增生性导管结构所占比例。

1.2.3 免疫组织化学染色

将组织切片脱蜡，浸到梯度酒精中进行水合，然后放到提前预热的抗原修复液中，15 min后放入封闭内源性过氧化物酶中，取出进行细胞透膜，然后敷血清和一抗，过夜后去掉一抗，敷二抗并染DAB，观察到棕色后进行苏木精复染， 然后酒精脱水，最后封片保存。显微镜下观察Ki67和ERα的表达情况，当1个导管染上棕色的细胞数占总细胞数比例大于或等于20%时，认为该导管表达此抗原。计算Ki67和ERα表达导管所占比例。

1.2.4 统计分析

采用Graphpad Prism 6软件对数据进行单因素方差分析及t检验，测定结果以平均值±标准差表示，P<0.05时判定为差异显著。

2 结果与分析

2.1 对青春期小鼠肝脏、子宫的影响

肝脏作为外来药物代谢的重要器官，它的变化反映药物毒性的大小。图1所示，处理组肝脏指数没有显著变化，表明该剂量纳米二氧化钛对小鼠未产生显著的毒性效应。子宫作为哺乳动物重要的生殖器官，对乳腺的发育具有重要的调节作用。实验结果显示，处理组小鼠子宫长度和宽度均未发生明显的变化，说明纳米二氧化钛对小鼠子宫形态无显著影响。

图1 小鼠的肝脏指数与子宫的长宽度

2.2 对青春期小鼠乳腺导管形态的影响

小鼠乳腺导管密度和末端芽数量见图2。如图所示，低剂量处理组小鼠乳腺末端芽数量较对照组显著增加，高剂量处理组乳腺导管密度较对照组降低。

图2 小鼠乳腺形态学结构

2.3 对青春期小鼠乳腺病理学结构的影响

正常的乳腺导管结构由2层细胞构成，这种结构有利于小鼠怀孕时导管分化为腺泡，便于乳汁的分泌与输送。当乳腺发生病变时，出现多层细胞的增生，怀孕时导管分化为腺泡和腺泡分泌乳汁的能力降低。如图3所示，低剂量纳米二氧化钛处理以后，增生性导管的比例有增加的趋势，高剂量暴露对增生性导管的比例没有明显的影响。

图3 小鼠乳腺组织病理学结构

2.4 对青春期小鼠乳腺导管Ki67和ERα表达的影响

对乳腺导管分别进行Ki67和ERα染色，以研究纳米二氧化钛对乳腺的作用机制。Ki67是增殖蛋白，处在有丝分裂期的细胞高表达Ki67，主要定位在细胞核中。ERα为雌激素受体，主要表达在乳腺的管腔干细胞中，在细胞膜、细胞质、细胞核中都有表达。雌激素与细胞核上的雌激素受体结合可引发基因调控机制，进一步控制下游基因的转录。如图4所示，低剂量纳米二氧化钛暴露显著增加青春期小鼠乳腺导管Ki67和ERα的表达。

图4 小鼠乳腺导管Ki67和ERα的表达

3 讨论

本研究对C57BL/6-GFP转基因雌性小鼠在青春期时进行纳米二氧化钛暴露，研究发现，处理组小鼠肝脏指数、子宫长度和宽度均较对照组无显著差异。低剂量纳米二氧化钛处理后小鼠乳腺末端芽的数量显著增加，Ki67和ERα的表达量显著上升。高剂量纳米二氧化钛处理后小鼠乳腺导管密度降低。

已有纳米二氧化钛的安全性研究结果不一致，纳米二氧化钛的应用是否安全还没有明确的结论。纳米二氧化钛可通过呼吸道、消化道、皮肤以及注射等多种途径进入机体，损伤体内组织器官[12]。纳米二氧化钛具有小粒径效应，可通过简单的自由扩散和渗透方式进入体内，透过细胞膜进入细胞乃至核内，另外纳米二氧化钛具有高化学活性，这一特性促使细胞损伤，从而影响细胞的增殖、分化及凋亡[13-14]。

青春期乳腺导管密度、分支结构、末端芽的数量和病理学结构的异常变化是乳腺病变发展过程中的重要参考因素[15-16]。本研究结果显示，高剂量纳米二氧化钛处理后小鼠乳腺导管变得稀疏，可能是高剂量的纳米二氧化钛抑制了小鼠乳腺的发育，低剂量没有这一作用。青春期小鼠末端芽有促进导管分支、延长的作用[17]，研究发现，小鼠经低剂量纳米二氧化钛处理后，末端芽显著增加，说明低剂量纳米二氧化钛促进了乳腺的异常发育，但高剂量纳米二氧化钛的暴露对小鼠乳腺末端芽没有明显的影响。为了探究纳米二氧化钛的作用机制，对乳腺导管进行了Ki67和ERα染色。青春期小鼠低剂量纳米二氧化钛暴露能够使乳腺Ki67表达量显著增加，Ki67是反映细胞增殖能力的蛋白标志物，可能是纳米二氧化钛损伤乳腺细胞，机体为了平衡乳腺代谢，使处于静止期的乳腺干细胞进行快速增殖。在乳腺癌患者中，雌激素受体表达量与激素治疗是否敏感有关[18-19]，经低剂量纳米二氧化钛处理后小鼠乳腺导管高表达ERα蛋白。ERα是雌激素信号通路的下游蛋白，推测低剂量纳米二氧化钛可能通过干扰性激素信号通路影响乳腺的发育。高剂量纳米二氧化钛处理对小鼠乳腺导管Ki67和ERα的表达没有显著的影响，可能因为暴露剂量过高导致机体反应迟钝。本研究结果为进一步探究纳米二氧化钛对小鼠乳腺的毒性作用和潜在机制提供新的依据和启示。