陈晨，周刚，曹丽萍

作者单位：1 621900 绵阳,四川省科学城医院心内科

近几年，随着我国老龄化进程的加快，冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的发病率逐年上升，急性冠脉综合征（ACS）属于冠心病的一种危急重症，致死率较高[1]。目前，临床上关于ACS的具体发病机制尚不明确，根据患者不同的心肌缺血程度和侧支循环形成速度，表现出不同的临床症状[2]。因此如何准确判断血管病变程度，进行合理的分层治疗，对于提高治疗效果、降低医疗资源浪费具有十分重要的临床价值。目前冠状动脉（冠脉）造影（CAG）是临床上用于诊断冠心病及客观评价冠脉狭窄程度的金标准[3]，但是价格昂贵、属于侵入性操作，而很多生化标志物的敏感性较低，因此寻找新的特异性指标对冠脉狭窄程度进行客观评估对于进行个体化治疗具有重要的临床意义。随着RNA组学研究的深入，临床上逐渐关注miRNAs作为新的心血管疾病诊断和治疗标志物的潜力[4]。基于前期调查和研究，筛选与血管壁内皮细胞密切相关的miR-499、miR-146a作为候选标志物，探讨miRNAs对冠脉狭窄程度的潜在诊断价值。现研究报告如下：

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组 连续入选2016年5月～2017年12月于四川省科学城医院心内科住院接受治疗的ACS患者139例，其中男性74例，女性65例，年龄为39～81（61.58±7.32）岁。患者纳入标准：①所有患者经CAG、临床症状以及辅助检查确诊为ACS[5]。②具有完整的临床资料；③由患者或家属签署知情同意书。排除标准：①不符合上述纳入标准的患者；②受试前1个月接受过溶栓、抗凝、抗血小板药物治疗者；③受试前1个月接受过激素、非甾体类抗炎药物、阿片受体激动剂等治疗者；④治疗前出现严重的意识障碍、高血压危象、急性心衰等患者；⑤合并先天性心脏病、风湿性心肌炎、病毒性心肌炎者；⑥合并严重的免疫系统疾病、血液系统疾病、急慢性严重感染、严重出血倾向者；⑦合并严重的肝肾功能损伤、恶性肿瘤者。根据ACS患者临床表现，心电图变化等，将ACS患者又分为两个亚组，包括急性心肌梗死（AMI）（n=68例）和不稳定型心绞痛（UA）（n=71例）。另外选择同时期在我院因相同的胸痛症状就诊，进行CAG检查未发现结果异常，心肌酶和心肌肌钙蛋白检查呈阴性的42例受试者作为对照组纳入本项研究。本项研究已获得伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 冠状动脉造影术（CAG） 患者在检查前，适度放松手腕，自桡骨茎突上2 cm处行穿刺，经鞘管注射3000～6000 U肝素，对左右冠状动脉进行全方位拍片检查，采用DSA图像处理系统定量分析冠状动脉病变支数和狭窄程度。

1.2.2 病变支数 ①单支病变：左冠状动脉的左前降支（LAD）、左回旋支（LCX）、右冠状动脉（RCA）中任一单支血管狭窄＞50%。②双支病变：LAD、LCX、RCA中任意两单支血管狭窄>50%或者左主干（LM）病变。③三支病变：LAD、LCX、RCA均狭窄，或者LM合并RCA同时病变。

1.2.3 冠状动脉病变程度 采用Gensini评分系统来评价：1分，狭窄＜25%；2分，25%～50%狭窄；4分：51%～75%狭窄；8分：76%～90%狭窄；16分：91%～99%狭窄；32分，100%狭窄。冠状动脉个段所占的系数：LM×5；前降支近、中、远段分别×2.5、×1.5、×1；第一及第二对角支分别×1、×0.5；回旋支近、中、远段分别×2.5、×1.5、×1；右冠状动脉近段、中段、远段、后降支、左室后支分别×1，所有病变得分相加为最后总分。根据Gensini评分，0～30分定义为轻度病变，31～60分定义为中度病变，＞60分定义为重度病变。

1.2.4 实验室指标的检测 所有受试者入院后24 h内采集空腹肘静脉血5 ml，置于EDTA抗凝管（法国Becton Dickinson公司提供）中。将血液样本于室温下离心300 g×10 min，取上清，迈瑞BS-350型全自动生化分析仪（中国迈瑞公司提供）检测血小板计数（PLT）、心肌肌钙蛋白（cTnI）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

1.2.5 miRNA的检测

1.2.5.1 血小板提取和纯化 ①将血液样本室温下160 g离心6 min，取中层上清液，约3 mm，即为富含血小板血浆；②将富含血小板血浆置于离心管中，加入等体积的改良HEPES台式液，室温下300 g离心10 min，弃上清；③加入3 ml改良HEPES台式液重悬，离心，弃上清，重复三次，收集血小板球；④采用流式细胞术检测血小板纯度。

1.2.5.2 血小板RNA提取 ①收集血小板1×1010个，置于EP管中；②按照Ambion RNA提取分离试剂盒（日本Takara公司提供）说明书步骤进行操作。③将提取的RNA溶液分装，置于-80℃保存备用。④采用凝胶电泳检测RNA分子量；采用分光光度计检测RNA浓度。

1.2.5.3 RNA反转录 根据逆转录试剂盒（日本Takara公司提供）说明书操作进行。将cDNA保存至-20℃保存备用。

1.2.5.4 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）采用CFX-96-C1000 real-time PCR仪（美国Bio-Rad公司提供）按照三步法进行PCR扩增。实验结束后采用miRNA PCR Array Data Analysis Software进行数据分析 。

1.3 统计学处理 所有数据均采用SPSS 17.0统计学软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 两组患者年龄、性别、体质指数（BMI）、糖尿病史、高血压病史、高脂血症史、吸烟史基本一致，无统计学差异（P均＞0.05，表1）。

2.2 两组患者生化指标检测结果比较 比较两组受试者入院时血液生化指标，结果显示，ACS患者PLT、cTnI含量高于对照组受试者，统计具有统计学意义，P均＜0.05；两组受试者其他各项指标包括FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平值无统计学差异，P均＞0.05（表2）。

2.3 受试者血小板miR-499、miR-146a表达情况及Gensini评分比较 ACS患者中，UA组和AMI组的血小板miR-499、miR-146a相对表达值以及Gensini评分均高于对照组患者，差异具有统计学意义，P均＜0.05。同时，AMI组患者血小板miR-499、miR-146a相对表达值及Gensini评分均高于UA患者，差异具有统计学意义，P均＜0.05（表3）。

2.4 不同病变支数ACS患者血小板miR-499、miR-146a表达情况比较 三支病变的ACS患者血小板miR-499、miR-146a相对表达值以及Gensini评分最高，与其他两个亚组患者比较，差异有统计学意义，P＜0.05。说明病变血管越多，Gensini评分越高，血小板miR-499、miR-146a相对表达水平也越高（表4）。

2.5 不同冠脉病变程度ACS患者血小板miR-499、miR-146a表达情况比较 冠脉病变程度越高，血小板miR-499、miR-146a表达水平越高，三个不同冠脉病变程度亚组患者，血小板miR-499、miR-146a相对表达值存在统计学差异，P＜0.05（表5）。

表1 患者的一般临床资料分析

表2 两组受试者入院时检查结果比较（±s）

表2 两组受试者入院时检查结果比较（±s）

注：ACS：急性冠脉综合征；PLT：血小板计数；cTnI：心肌肌钙蛋白；FPG：空腹血糖； TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

项目 对照组（n=42） ACS组（n=139） P值PLT（×109/L） 169.45±31.74 227.15±65.89 0.000 cTnI（μg/l） 0.17±0.42 6.93±10.85 0.000 FPG（mmol/l） 5.38±1.45 5.77±1.21 0.083 TG（mmol/l） 1.85±1.09 1.97±1.14 0.547 TC（mmol/l） 4.12±1.44 4.58±1.65 0.105 HDL-C（mmol/l） 1.47±0.17 1.40±0.24 0.080 LDL-C（mmol/l） 2.35±0.25 2.46±0.34 0.054

表3 两组受试者血小板miR-499、miR-146a表达情况和Gensini评分比较（±s）

表3 两组受试者血小板miR-499、miR-146a表达情况和Gensini评分比较（±s）

注：ACS：急性冠脉综合征；UA：不稳定心绞痛；AMI：急性心肌梗死；与对照组比较，aP＜0.05；与UA组比较，bP＜0.05

项目 对照组（n=42） UA（n=71） AMI（n=68）miR-499/β-actin1.01±0.18 1.43±0.17a1.95±0.14ab miR-146a/β-actin0.79±0.09 0.93±0.15a1.27±0.22ab Gensini评分 15.41±0.25 48.59±12.47a57.94±13.26ab

2.6 血小板miR-499、miR-146a表达情况与Gensini评分相关性分析 采用Pearson相关性分析，ACS患者Gensini评分与血小板miR-499、miR-146a表达呈正相关性，r分别为0.785，0.806，P均＜0.05，（表6，图1）。

3 讨论

冠心病是全球包括我国致死率最高的心脑血管疾病之一，近些年发病人数逐年上升呈年轻化趋势，给患者家庭和社会医疗增加极大的经济负担。ACS属于冠心病最严重、最复杂的危急重症[6]。多项研究证实，冠脉形成不稳定的硬化斑块，斑块破裂、钙化、糜烂等导致冠脉腔狭窄与ACS的发生发展密切相关[7]。动脉粥样硬化斑块主要由两部分组成，包括胶原纤维帽和富含脂质的脂质核心[8]。胶原纤维帽可稳定斑块，而脂质核心是由巨噬细胞吞噬大量LDL-C后，导致溶酶体破裂最终引起斑块破裂[9]。斑块一旦破裂，血小板迅速聚集形成白色血栓，通常表现为非ST段持续抬高心肌梗死；若斑块破裂严重，则会大量黏附纤维蛋白形成红色血栓，导致冠状动脉完全闭塞，形成ST段持续抬高型心肌梗死[10]。因此血小板是影响这一系列病理过程的关键因素，不仅可以释放大量细胞因子参与ACS的发生和发展；同时也可作为炎性细胞激活或释放炎性因子参与动脉粥样硬化的形成[11]。

表4 不同病变支数ACS患者血小板miR-499、miR-146a表达情况和Gensini评分比较（±s）

表4 不同病变支数ACS患者血小板miR-499、miR-146a表达情况和Gensini评分比较（±s）

注：与单支病变亚组比较，aP＜0.05；与双支病变亚组比较，bP＜0.05

三支病变亚组（n=49）miR-499/β-actin1.32±0.18 1.75±0.23a2.08±0.26ab miR-146/β-actin0.84±0.12 0.96±0.20a1.33±0.17ab Gensini评分 34.23±9.7550.42±12.64a63.78±10.39ab项目 单支病变亚组（n=37）双支病变亚组（n=53）

表5 不同冠脉病变程度ACS患者血小板miR-499、miR-146a表达情况（±s）

表5 不同冠脉病变程度ACS患者血小板miR-499、miR-146a表达情况（±s）

注：与轻度病变亚组比较，aP＜0.05；与中度病变亚组比较，bP＜0.05

项目 轻度病变亚组（n=25）重度病变亚组（n=36）miR-499/β-actin1.23±0.11 1.64±0.32a2.19±0.15ab miR-146a/β-actin0.86±0.09 1.15±0.16a1.42±0.18ab中度病变亚组（n=78）

表6 Gensini评分与血小板miR-499、miR-146a表达相关性分析

图1 Gensini评分与血小板miR-499、miR-146a表达相关性分析

目前，临床上用于诊断冠脉病变严重程度的金标准是CAG，是目前为止最可靠、最准确的冠脉病变诊断方法[12]。但是由于CAG检查费用昂贵、患者需提前预约，且属于有创性检查，风险较高，很多患者不愿意接受CAG检查，导致临床推广受限，从而影响ACS患者早期冠脉病变程度的判断和后续治疗方案的选择。目前临床上还会采用其他一些生化指标，包括cTnI、BNP、CRP等作为诊断手段[13]，但只作为冠脉发生病变的辅助检查手段，判断冠脉病变程度的敏感性和特异性较低。

miRNAs是真核生物基因中一类非编码的负性调控RNA，可以通过与靶基因3’-非编码区结合抑制RNA转录[14]。目前，关于miRNAs与肿瘤和心脑血管疾病之间的关系研究已经成为全球医学界的热点。国外有学者通过生物信息学和基因芯片技术，初选ACS患者与健康人群具有表达差异性的miRNA谱，包括miR-499、miR-146a等多种基因呈高表达，从而证实大量miRNAs参与冠状动脉粥样硬化、血小板活化、易损斑块破裂等过程。但是由于基因芯片技术虽然简单易行，筛选信息量大，但是敏感度较低，而且成本昂贵，qRT-PCR是目前实验室和临床检验科最常使用的可靠的检测方式，因此笔者希望通过本项研究探讨采用qRT-PCR检测血小板miR-499和miR-146a作为冠脉病变程度诊断标志物的可行性。结果显示，ACS患者血小板miR-499和miR-146a表达水平明显高于非CHD受试者，且患者冠脉病变程度越高，血小板miR-499和miR-146a表达水平越高。提示miR-499和miR-146a与ACS的发生密切相关，且随着病情加重而表达上调。经Spearman相关性分析结果显示，ACS患者Gensini评分与血小板miR-499、miR-146a表达呈正相关性，说明血小板miR-499、miR-146a表达水平与冠脉病变严重程度之间有一定的影响。

综上所述，我们首次探讨血小板miR-499、miR-146a表达水平与ACS的发生以及冠脉病变程度的相关性，可作为ACS诊断和预测疾病严重程度的潜在分子标志物，同时也为ACS的个体化基因治疗提供潜在的靶点和方向。