岳媛，范秋灵，都姝妍，远方，徐莉，李琳，刘楠，姜奕，王力宁

（1.中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳 110001；2.辽宁中医药大学附属医院肾内科，沈阳 110032；3.中国医科大学附属第一医院中心实验室，沈阳 110001）

糖尿病肾病 （diabetic nephropathy，DN） 是糖尿病的严重并发症，是导致终末期肾脏病的最常见原因［1］，其发病机制尚未明确，尚无有效药物可以逆转或阻止其进展，已成为世界范围内亟待解决的公共卫生问题。系膜细胞是肾小球固有细胞，也是肾小球内最活跃的细胞，正常情况下无明显增殖，而在病理条件下则出现异常增殖，导致肾小球硬化。机械因素、代谢因素以及多种调节分子 （包括某些血管活性物质、细胞因子） 等与肾小球硬化的启动及进展密切相关［2］，若不给予适当治疗肾小球硬化将进一步加重［3］，最终导致终末期肾病。乌索酸 （ursolic acid，UA） 是一种来源于植物的五环三萜类化合物，广泛存在于浆果、水果及中草药中，具有抗肿瘤、降血糖、降血脂及抗动脉粥样硬化作用［4-6］。本研究探讨UA对高糖状态下系膜细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

人肾小球系膜细胞和HMC4201培养基购自美国Sciencell公司；乌索酸 （89797） 购自美国Sigma公司；MTT粉、AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购于北京宝赛生物技术有限公司；TrizolRNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；Go Taqq PCR Master Mix购自美国Promega公司；兔抗Bcl-xl多克隆抗体购自美国Cell Signal Technology；兔 抗TGF-β1、FN、Bax、survivin多 克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体购自美国Proteintech公司；HRP标记羊抗兔IgG购自美国Abcam公司。Power Wave XS2全波长酶标仪 （美国Bio-Tek公司） 、FACS Calibur流式细胞仪 （美国BD公司） 、Mini Transblot 电转膜系统 （美国Bio-Blot公司） 、相差倒置显微镜 （日本Olympus公司） 、 Rotor-Gene 3000 PCR仪 （美国Agilent公司） 。

1.2 细胞培养

人系膜细胞复苏后，接种于培养瓶中，用MCM 4201完全培养基常规培养，置于37 ℃、饱和湿度5% CO2的孵箱内贴壁传代培养，隔天换液1次，取5～9代对数生长期细胞，消化后制成单细胞悬液，分为正常糖组、高糖组、高渗对照组、UA治疗A、B、C组。正常糖组5.5 mmol·L-1葡萄糖培养；高糖组30.0 mmol·L-1葡萄糖培养；高渗对照组5.5 mmol·L-1葡萄糖+24.5 mmol·L-1甘露醇培养；UA治疗A、B、C组分别30.0 mmol·L-1葡 萄 糖+0.5、1.0、2.0 µmol·L-1UA培养。6组均培养48 h后收集细胞。

1.3 方法

1.3.1 MTT法检测细胞增殖：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入150 µL培养液，铺板，5%CO2，37 ℃孵育至细胞单层铺满孔底 （96孔板） ，每孔加入刺激因素150 µL，分别孵育24 h、48 h后镜下观察。每孔加入20 µL 0.5%MTT溶液培养4 h后加入150 µL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，于570 nm处用酶联免疫检测仪测量各孔光密度 （OD） 值，计算细胞增殖率。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡：采用Annexin-V/PI双染法。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每瓶加入5 mL培养液，调细胞密度至5×105/瓶。5%CO2，37 ℃孵育至细胞贴壁，换含有不同刺激因素的培养液，孵育48 h后每孔加600 µL胰蛋白酶消化，离心5 min后弃上清液，加入缓冲液（500 µL）悬浮细胞并移入流式管，同时加入PI （5 µL） 和AnnexinV-FITC（5 µL） 避光反应10 min，经流式细胞仪分析。

1.3.3 实时PCR检测Bcl-xl、survivin、Bax、转化生长因子β1 （transforming growth factor β1，TGF-β1） 、纤连蛋白 （fibronectin，FN） mRNA水平：按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总NRA，紫外分光光度计测量RNA浓度，逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书进行。FN正义链，5’-CCGCCATTAATGAGAGT GAT-3’，反 义 链，5’-AGTTAGTTGCGGCAGGAGAA G-3’，长度133bp；TGF-β1正义链，5’-GCCCTGGACA CCAACTATTGC-3’，反义链，5’-AGGCTCCAAATGT AGGGGCAGG-3’，长度161bp；survivin正义链，5’-GC TGGCTTCATCCATCCACTGC-3’，反义链，5’-CAATT TTGTTCTTGGCTCT-3’， 长度220bp； Bcl-xl正义链，5’-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3’，反义链，5’-GC GATCCGACTCACCAATAC-3’，长度448bp；Bax正义链，5’-GACGAGGATTGCTGATA-3’，反义链，5’-CTC AGCCCATATTCTTCCAG-3’，长度354bp；β-actin正义链，5’-CCATGTACGTTGCTATCCAGG-3’，反 义 链，5’-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3’，长 度252 bp；引物由日本TaKaRa公司合成。β-actin作为内参对照基因，实验数据处理用2-ΔΔCT方法进行，计算样本mRNA/β-actin mRNA的比值。

1.3.4 Western blotting检测各组细胞Bcl-xl、survivin、Bax、TGF-β1、FN蛋白表达：收集各组细胞，加入60µL蛋白裂解液及0.6 µL蛋白酶抑制剂，超声破碎20 min后离心5 min，吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度，并调整至5 µg/µL；7.5%、10%、12% SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h，一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜加二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，滴加ECL发光液后观察。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 UA对系膜细胞增殖的抑制作用

结果显示，24 h各组系膜细胞增殖差异无统计学意义 （P ＞ 0.05） ，48 h高糖组系膜细胞增殖率明显高于正常糖组 （P ＜ 0.05）；0.5、1.0、2.0 µmol·L-1UA治疗组系膜细胞的增殖率呈剂量依赖性下降，1.0µmol·L-1UA治疗组系膜细胞增殖率明显低于高糖组 （P ＜ 0.05） ，细胞生长状态良好；2.0 µmol·L-1UA治疗组大部分系膜细胞已经死亡，增殖率明显低于高糖组 （P ＜ 0.05） 。高渗对照组与正常糖组及0.5µmol·L-1UA治疗组系膜细胞增殖率无统计学差异（P ＞ 0.05） 。提示1.0 µmol·L-1UA能明显抑制高糖诱导的系膜细胞增殖且细胞状态良好，可作为后续试验的最佳治疗剂量。见表1。

2.2 UA对系膜细胞凋亡的影响

表1 UA对系膜细胞增殖的影响 Tab.1 Effect of ursolic acid on mesangial cell proliferation

表1 UA对系膜细胞增殖的影响 Tab.1 Effect of ursolic acid on mesangial cell proliferation

1） P ＜ 0.05 compared with normal glucose group；2） P ＜ 0.05 compared with high glucose group.

Proliferation of mesangial cells 24 h 48 h Normal glucose group 2.66±0.04 3.66±0.32 High glucose group 2.70±0.02 4.33±0.231）High osmotic group 2.61±0.02 3.50±0.22 0.5 µmol·L-1 ursolic acid group 2.69±0.03 3.93±0.11 1.0 µmol·L-1 ursolic acid group 2.66±0.02 3.59±0.062）2.0 µmol·L-1 ursolic acid group 1.69±0.062） 0.67±0.162）Group

48 h各组系膜细胞凋亡率如图1所示。正常糖组、高糖组、高渗对照组、UA治疗组凋亡率分别为（12.21±0.51） %、 （12.98±0.27） %、 （15.04±0.33） %、（23.02±0.45） %。高糖组与正常糖组比较差异无统计学意义 （P ＞ 0.05） ，而UA治疗组系膜细胞凋亡率显著高于高糖组 （P ＜ 0.05） 。提示UA促进系膜细胞凋亡，抑制系膜细胞增殖。

图1 流式细胞仪分析UA对系膜细胞凋亡的影响Fig.1 Flow cytometry was performed to analyze the effect of ursolic acid on apoptosis in mesangial cells

2.3 UA对系膜细胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax表达的影响

图2 各组系膜细胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax mRNA的表达Fig.2 Effects of ursolic acid on the expression of FN，TGF-β1，Bcl-xl，survivin，and Bax mRNA in mesangial cells

结果显示，与正常糖组比较，高糖组FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin表达明显增高 （P ＜ 0.05） ，Bax的表达无明显变化；与高糖组比较，UA治疗组FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin表达明显降低 （P ＜ 0.05） ，Bax表达明显增高 （P ＜ 0.05） 。见图2、3。

图3 各组系膜细胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax蛋白的表达Fig.3 Effects of ursolic acid on the expression of FN，TGF-β1，Bcl-xl，survivin，and Bax proteins in mesangial cells

3 讨论

DN是糖尿病最重要的并发症，同时也是一个连续的病理变化过程，早期阶段包括系膜细胞增殖、肾小球肥大、基底膜增厚及细胞外基质蛋白聚集，晚期阶段为肾小球硬化及间质纤维化，最终导致肾脏功能的丧失［7-10］，细胞外基质蛋白（FN）、Ⅳ型胶原的过多沉积是DN肾脏进展性纤维化的病理基础。前期研究［7］发现高糖刺激人系膜细胞48 h，系膜细胞明显增殖，伴有细胞因子（TGF-β1）、细胞外基质蛋白（FN）的表达增强，提示高糖介导了系膜细胞的增殖与细胞外基质聚集，诱导系膜细胞损伤。近年研究［11-12］提示在DN早期细胞凋亡有利于清除过多的增殖细胞，延缓DN进程。

既往研究［13-14］发现UA诱导Bax/Bcl-2途径使线粒体释放细胞色素C （cytochrome C，CytC） 诱导肿瘤细胞凋亡。吴斌等［5］研究发现UA通过抑制AKt磷酸化促进线粒体释放CytC，诱导恶性肿瘤细胞Jurkat凋亡。刘玲等［14］研究发现三萜类化合物 （齐墩果酸）可使肝癌细胞Bcl-2表达减少，Bax表达增加，CytC在线粒体中表达降低而在胞质中表达增加，从而抑制肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡，可能与其影响线粒体功能和能量代谢有关。本研究同样发现UA抑制Bcl-xL表达、促进Bax表达，Bax可与线粒体膜上的电压依赖性阴离子通道蛋白孔道形成复合物，释放CytC，参与并诱导细胞凋亡，缓解细胞损伤。因此UA可能通过促进Bax表达，参与并诱导线粒体释放CytC，启动系膜细胞凋亡，维持系膜细胞正常增殖水平。

综上所述，UA可以诱导系膜细胞早期凋亡，缓解高糖诱导的系膜细胞损伤，为UA对DN的早期治疗提供了新的实验依据。