卢金霞，何 芳，冯 峰，管翠萍，刘军红，周学章

(1 宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

奶牛乳房炎又称奶牛乳腺炎(Bovine mastitis)，是奶牛乳腺受物理、化学、微生物刺激所发生的一种炎症变化，是一种复杂的乳腺综合症，包括乳腺感染、乳腺炎症、乳房微循环和免疫障碍等[1-2]，多发生于产后哺乳期，常可引起奶牛产奶量和奶品质急剧下降甚至失去泌乳能力。在乳腺免疫防御体系中，奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)具有哨兵作用，其能够及时识别病原菌并释放细胞因子，趋化、激活及调节免疫细胞，进而发挥免疫防御功能[3]。随着人们对食品安全要求的不断提高和国家对乳制品品质更严格的要求，临床治疗乳房炎常用的抗生素由于存在药物残留将逐渐被限用或禁用。应用中药治疗奶牛乳房炎，已日益为国内外专家所关注。

苦参碱(Matrine)是豆科植物苦参(SophoraflaescensAit.)的主要有效成分，也存在于苦豆子(S.alopecuroidesL.)、广豆根(S.subprostrataChun et T.Chen)中。苦参碱具有多种生理学活性，具有消炎抗菌、抗过敏、抗心率失常等作用[4]。有研究发现，苦参碱能显著降低慢性肝炎患者血清中透明质酸、Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白的含量，提示苦参碱具有抗炎及抑制肝纤维化的作用[5]。据报道，主要成分由丹参、茜草、苦参提取物组成的复方茜草灌注液对临床型乳房炎的疗效优于抗生素(青霉素钠+链霉素+生理盐水)[6]。但有关苦参碱对体外培养的BMECs增殖、凋亡及抗氧化能力影响的研究未见报道。为此，本试验对此进行探讨，为研制苦参碱制剂及其在奶牛乳房炎防治中的应用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细 胞 BMECs由本实验室通过组织块培养法分离鉴定所得。

1.1.2 试剂与仪器 (1)试剂。苦参碱(纯度99.22%)、二甲基亚砜(DMSO)，购自Solarbio公司；胎牛血清，购自Gibco公司；双抗、DMEM/F12培养基，购自HyClone公司；氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、孕酮，均购自Sigma公司；RNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司； 一氧化氮(NO)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、AnnexinV/PI双染细胞凋亡试剂盒、四甲基偶氮唑盐(MTT)法细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，均购于南京凯基生物发展有限公司。

(2)仪器。SW-CJ-1F洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，HF90CO2恒温培养箱(上海力申科学仪器有限公司)，AE2000倒置相差显微镜(Motic公司)，TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器公司)，CyFlow Cube流式细胞仪(德国Partec公司)，680酶标仪和IQ5荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)，Nanodrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 苦参碱对BMECs增殖的影响

按1.0×104孔-1的量将BMECs接种到96孔板，分为A、B、C、D和E 5组，每组3个重复，分别用含0，25，50，75和100 μg/mL苦参碱的培养基进行培养，于培养的第3，4，5天，弃去培养液，在每孔中加入50 μL 1×MTT，37 ℃孵育4 h后弃去液体，加入DMSO 150 μL/孔，平板摇床摇匀后，用酶标仪于490 nm下测定吸光度(D490 nm)。

1.3 苦参碱对BMECs完整性和泌乳能力的影响

按7.0×104孔-1的量将BMECs接种到12孔板，分组和处理方法同1.2，于培养的第5天，分别用NO试剂盒、LDH测试盒测定细胞培养上清液中NO与LDH含量。

1.4 苦参碱对BMECs凋亡的影响

按1×106孔-1的量将BMECs接种到6孔板，分组和处理方法同1.2，于培养的第5天，采用流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)测算细胞凋亡率。

1.5 苦参碱对BMECs抗氧化能力的影响

按7.0×104孔-1的量将BMECs接种到12孔板，分组和处理方法同1.2，于培养的第5天，用相应试剂盒测定CAT、GSH-Px、SOD活性及MDA含量。

1.6 苦参碱对BMECs中p53、STAT1、Caspase-3和SOCS3基因mRNA表达水平的影响

以β-actin为内参基因，采用real-time PCR法检测苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞p53、STAT1、Caspase-3、SOCS3基因mRNA表达水平的影响。参考文献[7]设计p53、STAT1、Caspase-3、SOCS3、β-actin基因的real-time PCR引物，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 p53、STAT1、Caspase-3和SOCS3的引物序列及产物长度Table 1 Primers and product lengths of p53,STAT1,Caspase-3 and SOCS3 gene

按1.0×106孔-1将BMECs接种到6孔板，处理方法同1.2，培养5 d后，严格按照天根总RNA提取试剂盒的说明提取细胞总RNA，使用Nano Drop仪器测定总RNA浓度和纯度后，采用Takara反转录试剂盒进行cDNA合成。严格按照Takara试剂盒说明书，配制20 μL real-time PCR反应体系：SYBR预混合试剂Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus) 2×10 μL，10 μmol/L PCR正向引物0.8 μL，10 μmol/L PCR反向引物0.8 μL，cDNA模板2 μL，灭菌蒸馏水6.4 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s；65 ℃延伸15 s，共40个循环。反应在伯乐iQ5 real-time PCR System实时PCR检测系统上进行。

1.7 数据分析

用Excel对试验数据进行预处理，结果以“平均值±标准差”表示；采用SPSS 17.0单因素方差分析(ANOVA)法对试验数据进行统计分析，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法进行计算。

2 结果与分析

2.1 苦参碱对BMECs增殖的影响

由图1可知，培养第3天，B～E组BMECs的增殖水平均低于A组，其中C、D、E组与A组差异极显著(P<0.01)；培养第4天，B、C、D、E组BMECs细胞增殖水平与A组相比无显著性差异；培养第5天，B、C组细胞增殖水平高于A组，其中B组与A组差异极显著(P<0.01)，D、E组细胞增殖水平略低于A组，说明低质量浓度(25和50 μg/mL)苦参碱对细胞增殖具有促进作用，而高质量浓度(75和100 μg/mL)苦参碱对细胞增殖具有抑制作用。

2.2 苦参碱对BMECs完整性和泌乳能力的影响

LDH是机体能量代谢过程中的重要酶，能催化乳酸脱氢生成丙酮酸，一般存在于细胞浆内，细胞膜受损时则会溢出胞外至培养上清中[8]。由图2可知，B～E组BMECs上清液中NO水平均高于A组，其中C组极显著高于A组(P<0.01)，表明苦参碱可以提高BMECs的泌乳性能；B、C、D和E组BMECs细胞上清液中的LDH水平均比A组的高，其中B、D组极显著升高(P<0.01)，C组显著升高(P<0.05)，说明苦参碱对细胞的完整性有一定的破坏作用。

2.3 苦参碱对BMECs凋亡率的影响

由图3可知，不同剂量的苦参碱作用于BMECs后，对细胞的凋亡率有不同程度的影响，B、C、D、E组BMECs的凋亡率均极显著高于A组(P<0.01)，其中B组细胞凋亡率最高。

与A组比较，*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。下图同Compared to group A,* indicates significant difference (P<0.05) and ** indicates extremely significant difference (P<0.01).The same below图1 苦参碱对BMECs增殖的影响Fig.1 Effects of matrine on proliferation of BMECs

图2 苦参碱对BMECs培养上清液中NO和LDH含量的影响Fig.2 Effects of matrine on NO and LDH contents in culture supernatant of BMECs

2.4 苦参碱对BMECs抗氧化能力的影响

由图4可知，B、C、D、E组BMECs的CAT活性均较A组高，其中C组极显著升高(P<0.01)；B、C、D、E组的GSH-Px活性均极显著高于A组(P<0.01)；除C组外，B、D和E组的SOD活性随着苦参碱质量浓度增加而明显升高，其中E组极显著升高(P<0.01)；B、C和D组的MDA含量较A组下降。综上可知，苦参碱可提高BMECs的抗氧化能力。

图4 苦参碱对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化能力的影响Fig.4 Effects of matrine on antioxidant ability of BMECs

2.5 苦参碱对BMECs中p53、Caspase-3、SOCS3和STAT1基因mRNA表达的影响

由图5可知，B～E组的Caspase-3基因相对表达量均高于A组，其中B、D、E组极显著高于A组(P<0.01)；B、C、D组的p53基因相对表达量极显著高于A组(P<0.01)，而E组略低于A组；苦参碱对各组细胞的STAT1基因相对表达量无显著影响；B、C、D和E组的SOCS3基因相对表达量均极显著高于A组(P<0.01)。上述结果说明，苦参碱可上调Caspase-3、p53和SOCS3基因的表达量。

图5 苦参碱对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因mRNA表达量的影响Fig.5 Effects of matrine on expressions of Caspase-3,p53,STAT1 and SOCS3 mRNA of BMECs

3 讨 论

BMECs是奶牛机体与外界直接接触的细胞，作为乳腺防御病原菌入侵的第一道防线，其数量大大超过其他参与抵御入侵病原菌的免疫细胞，在免疫防御过程中具有十分重要的作用。细胞增殖和凋亡间的动态平衡是维持机体稳态的一个重要方式[9]。本试验结果表明，苦参碱作用于BMECs第5天时，低剂量(25和50 μg/mL)药物既可促进细胞增殖又可促进细胞凋亡，高剂量(75和100 μg/mL)苦参碱可抑制细胞增殖而促进细胞凋亡。苦参碱在低剂量时既可促进细胞增殖又可促进细胞凋亡，原因可能为在此质量浓度下，苦参碱对细胞增殖的影响强于苦参碱对细胞凋亡的影响，综合表现为苦参碱促进细胞增殖；而在高质量浓度时，苦参碱既可抑制细胞增殖又可促进细胞凋亡，综合表现为抑制细胞增殖。随着泌乳期的改变，乳腺中NO的含量会发生变化，其含量在泌乳前期与妊娠后期达到最大，可见NO对促进泌乳具有重要作用[7]。在本试验中苦参碱提高了细胞的NO含量，表明其可以提高BMECs的泌乳性能。

在机体氧化反应过程中会产生具有传递能量等作用的自由基，但是机体内的自由基应在合适的范围内，过多或者过少都会对机体产生损害。这些自由基具有强氧化作用，会对机体在组织水平、细胞水平或分子水平产生损伤与破坏，最终导致疾病与衰老的发生[10]。GSH-Px、CAT与SOD是生物机体内重要的抗氧化酶，在清除自由基、H2O2和过氧化物以及减少羟基自由基形成等方面发挥着非常重要的作用[11-12]。MDA是自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的产物，其含量的多少间接反映了细胞内自由基的量。因此，通过测定机体SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量，在一定程度上可以反映机体的抗氧化能力[13]。本研究结果显示，苦参碱可提高BMECs的SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，表明苦参碱可提高细胞的抗氧化能力。

Zhang等[14]研究发现，苦参碱对人红白血病K562细胞的增殖抑制呈量-效关系和时-效关系，当苦参碱质量浓度为200 μg/mL且作用于细胞3 d后，细胞增殖速度明显减缓；当苦参碱质量浓度小于200 μg/mL时，对人红白血病K562细胞增殖无明显抑制作用；当苦参碱质量浓度大于200 μg/mL且作用2 d时，细胞增殖受到明显抑制，并表现出较强的杀伤力。周喜汉等[15]发现，500～2 000 μg/mL的苦参碱对结肠癌SW1116细胞的增殖具有显著抑制作用。本试验发现，25～100 μg/mL苦参碱作用3 d时，BMECs的增殖受到抑制；25～50 μg/mL苦参碱作用5 d时，可促进细胞的增殖，但当质量浓度在75～100 μg/mL时可抑制细胞的增殖，且与苦参碱质量浓度呈负相关。综上所述，在进行体外试验时，不同质量浓度范围内的苦参碱对不同细胞作用不同，提示在临床上治疗奶牛乳房炎时应选择合适的苦参碱质量浓度，即选择既能促进正常细胞增殖，又可诱导病变细胞凋亡的苦参碱质量浓度。

凋亡是一个蛋白酶级联反应过程。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是介导此过程的重要成分，其可分为执行者(包括Caspase-3、6、7)和启动者(包括Caspase-8、9、10)，其中Caspase-3、6、7具有直接降解胞内结构蛋白和功能蛋白从而引起凋亡的作用，但是它们不可通过自催化或自剪接的方式激活；而Caspase-8、9、10在接受到信号刺激后能通过自剪接而激活，从而引起Caspase级联反应[16-17]。Caspase-3是调控细胞凋亡的关键蛋白酶，细胞凋亡的最后通路均与Caspase-3的活化有关[18]。p53调控一些仅有BH3区域的蛋白，诱导细胞凋亡的功能十分显著[19-20]。p53与STAT1在生物体内对于细胞周期与细胞凋亡有重要作用，且都能抑制细胞的癌变[7]。细胞因子信号传导抑制蛋白-3(SOCS3)具有负调节多种细胞因子和激素(包括LIF、IL-11、生长激素、胰岛素和瘦素)产生的信号传导过程的作用，这些信号传导过程的作用就涉及到了控制炎症过程、调节生长发育等方面[21]。已有研究证实，SOCS3可以抑制LPS、LIF、IL-2、IL-3、IL-4、IFN-γ和IFN-α产生的信号传导通路[22]。总体而言，SOCS3具有抑制和阻断信号传导通路的作用。在本试验中，苦参碱上调了Caspase-3、p53、SOCS3的表达，表明其可促进细胞凋亡，减轻炎症反应。