线婷，王荻，刘红柏

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070; 2.南京农业大学 无锡渔业学院，江苏 无锡 214081)

施氏鲟AcipenserschrenckiBrandt隶属于鲟形目、鲟科、鲟属，是中国黑龙江流域的大型经济鱼类，因其具有个体大、存活率高、肉质鲜美等特点，开发应用前景十分广阔。在水产养殖过程中，水温变化、水质恶化、疾病暴发等因素均会直接影响养殖动物的正常生长与发育，进而使养殖户蒙受经济损失。鱼类属于冷血变温动物,冷水性鱼类对高水温更加敏感[1]。高水温会一定程度抑制鱼类生长,并且损害鱼体健康甚至造成死亡[2]。当水域温度超过鱼类适宜生存的温度时，鱼体就会产生应激反应[3]，15～27 ℃为施氏鲟的最适生长水温[4]，高温会使其非特异性免疫功能受到抑制[5]。研究表明，当水温超过28 ℃时，鲟鱼的生理机能会受到严重损伤[6]。在养殖与运输过程中，水温改变会对施氏鲟免疫系统造成一定影响。因此，越来越多的技术人员致力于研发出能够增强鱼体自身机能、提高鱼体抗应激能力的免疫增强剂。

中草药富含多种生物活性物质，是一种绿色、安全的药品，近年来被越来越多的应用在水产养殖业中[7]。研究发现，中草药具有调节水产动物免疫功能[8]、提高水产动物摄食能力、增强水产动物抗应激能力等功效[9-10]。开发绿色、天然的抗应激中草药免疫增强剂以有效提高水产动物的免疫力已逐渐成为一种趋势。

中草药免疫增强剂在水产养殖中的应用正逐年增加。近年来，利用中草药提高水产动物的免疫力，预防疾病暴发一直是众多学者研究的热点[11]。刘波等[12]将含有大黄蒽醌提取物的饲料投喂建鲤CyprinuscarpiovarJian 70 d后，对鱼体进行高密度应激1 d，发现各试验组鱼的皮质醇、血糖浓度和溶菌酶活性均有不同程度的提高，其中不含大黄提取物的对照组最高；攻毒试验表明，大黄蒽醌提取物能提高建鲤抗应激能力；同样在高密度中应激7 d，也获得类似结果，进一步证明了大黄提取物在鱼类高密度应激中的保护作用。王广军等[13]发现，在饲料中添加中草药免疫添加剂能够使日本鳗鲡Anguillajaponica的免疫力显著增强。研究表明，黄芪多糖可有效增强齐口裂腹鱼Schizothoraxprenanti非特异性免疫功能[14]，甘草等七味中药组成的复方对大菱鲆Scophthalmusmaxima具有一定的免疫调节作用，可有效提高大菱鲆的免疫力[15]，茯苓等中草药组成的复方可提高施氏鲟非特异性免疫功能[16]。实际生产过程中，一些养殖技术人员也选择使用中草药免疫添加剂来增强水产动物的抗应激能力[17]。本试验中，研究了黄芪、甘草、茯苓3种中草药对施氏鲟的非特异性免疫功能的影响，旨在筛选出可有效提高施氏鲟免疫力的抗热应激中草药免疫增强剂。

1 材料与方法

1.1 材料

健康非免疫状态下的1+龄施氏鲟由中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术工程中心提供，体质量为(0.09～0.10) kg。

试验用中草药均购自哈药集团世一堂药店，烘干粉碎后备用。溶菌酶测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所。嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila(AH)菌株为黑龙江水产研究所鉴定保存菌株，细菌培养基为胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，购自哈尔滨伊事达生物工程有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 中草药方剂及药液的制备 试验选用黄芪Astragalusmongholicus(Am)、甘草Glycyrrhizauralensis(Gu)、茯苓Poriacocos(Pc) 3种中草药单方。每种称取100 g分别放入砂锅中清水浸泡30 min，小火煎熬45 min，过滤出药汁，再加水熬30 min，再次过滤，将两次药汁合并浓缩成100 mL，其中1 mL药液相当于1 g中草药方剂(干物质)的水煎剂，经高压灭菌后存放于冰箱(4 ℃)中备用。

1.2.2 试验鱼的饲养及样品采集 随机选取施氏鲟于室内水族箱(0.90 m×0.50 m×0.45 m)预饲两周，水温恒定为22 ℃。保持各水族箱养殖条件一致，每天按鱼体质量的2.0%投喂全价基础饲料。结束预饲后，将黄芪、甘草、茯苓按照0.30、0.24、0.30 g/kg(体质量)的剂量每日给试验鱼口灌中草药水煎剂1次，连续给药21 d。给药结束后，随机选取半数鱼放入30 ℃的控温水族箱中热刺激2 h，然后与在正常水温(22 ℃)下的施氏鲟一同取样。从施氏鲟尾静脉采血，取全血置于离心管中，并于冰箱(4 ℃)中静置2 h，待血液凝固后，于4 ℃下以3500 r/min离心10 min，仔细吸取上层血清于-20 ℃下保存，并取鱼鳃、肝、幽门毛囊、胃、肠等组织样品，立即于-80 ℃下保存。

1.2.3 样品处理 准确称取施氏鲟组织样品与预冷的生理盐水按1 mg∶9 mL的比例稀释，用组织捣碎机以10 000～15 000 r/min充分研磨制成10%的匀浆，各组织匀浆于4 ℃下以3500 r/min离心10 min，取上清液进行检测。血清常温放置30 min融化后即可检测。每个检测指标的样本数为15尾，均设3个平行样。

1.2.4 生化指标检测 采用Beckman公司生产的CYNCHRON CH4PRO全自动生化分析仪进行检测。检测指标包括总蛋白、白蛋白、球蛋白含量和白/球蛋白比例。

1.2.5 白细胞吞噬率测定 将复苏保存的嗜水气单胞菌菌株，于37 ℃基础液体培养基中摇菌18 h，菌液水浴煮沸10 min后用于白细胞吞噬的测定[18]，计算公式为

吞噬指数(PI) =(100个白细胞内的细菌总数/参与吞噬的白细胞数),

吞噬率(PP)=100个吞噬细胞中参与吞噬的白细胞数。

1.2.6 溶菌酶含量的测定 施氏鲟血清及各组织溶菌酶测定方法参照刘红柏等[19]的方法进行。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 19软件进行单因素方差分析，采用邓肯氏法进行多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 施氏鲟血清中蛋白含量及白/球蛋白比例的变化

从表1可见：茯苓-常温组施氏鲟血清中总蛋白含量最高，且显著高于黄芪-常温组(P<0.05)；球蛋白和白蛋白含量最高值也出现在茯苓-常温组；在高温热应激下，茯苓作用下的施氏鲟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量均较常温下有所降低；黄芪-常温组施氏鲟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量及白/球蛋白比例与对照组相比均降低，且为各组最低值。

表1口灌中草药后施氏鲟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量和白/球蛋白比例的变化(21d)

Tab.1Contentsoftotalprotein,albumin,andglobulin,andtheratioofalbumincontenttoglobulincontentintheserumofAmursturgeonwithoraladministrationofChineseherbalmedicines(21days)

组别group总蛋白/(g·L-1)TP白蛋白/(g·L-1)ALB球蛋白/(g·L-1)GLU白/球蛋白比例A/G对照-常温 normal temperature control 18.75±1.97ab7.53±1.06a11.23±1.01ab0.67±0.05a对照-高温 high temperature control 19.33±4.94ab7.53±2.08a11.80±2.90ab0.64±0.05a黄芪-常温 Aastragalus membranaceus-normal tempera-ture 17.58±2.19a6.63±1.12a10.95±1.16a0.60±0.06a黄芪-高温 Astragalus membranaceus-high temperature 20.25±1.61ab8.38±0.64a11.88±1.15ab0.71±0.06a甘草-常温 Glycyrrhiza uralensis-normal temperature 20.38±1.62ab7.85±1.21a12.53±0.71ab0.63±0.09a甘草-高温 Glycyrrhiza uralensis-high temperature 22.05±3.68ab8.65±1.52a13.40±2.28ab0.65±0.06a茯苓-常温 Poria cocos-normal temperature 22.85±1.71b8.83±1.47a14.03±0.84b0.63±0.11a茯苓-高温 Poria cocos-high temperature 19.80±4.06ab7.85±1.57a11.95±2.62ab0.66±0.08a

注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

2.2 施氏鲟血清中白细胞吞噬作用的变化

从表2可见：施氏鲟白细胞吞噬率最高值出现在对照-常温组，最低值出现在茯苓-常温组，甘草-高温、甘草-常温、茯苓-常温组白细胞吞噬率均显著低于对照组(P<0.05);甘草-常温组吞噬细菌个数最低，仅为50个左右;高温热应激下，茯苓和黄芪作用下的施氏鲟血清白细胞吞噬指数显著高于对照组(P<0.05)。

表2口灌中草药后施氏鲟白细胞吞噬作用的变化

Tab.2ChangesinleukocytephagocytosisofAmursturgeonexposedtoChineseherbalmedicines

组别group吞噬率/%PP吞噬细菌数/个number吞噬指数PI对照-常温DZ-CT22.33±2.19a61.45±8.512.79±0.65a对照-高温DZ-HT20.78±1.71a74.33±12.533.56±0.32a黄芪-常温Am-CT19.55±0.69a59.33±6.443.03±0.24a黄芪-高温Am-HT19.89±2.14a73.56±7.173.72±0.50b甘草-常温Gu-CT17.11±1.54b50.00±6.442.91±0.21a甘草-高温Gu-HT18.44±1.39b57.55±5.553.12±0.27a茯苓-常温Pc-CT16.22±0.69b56.00±6.643.45±0.51a茯苓-高温Pc-HT19.67±2.91a77.22±24.593.88±0.64b

2.3 施氏鲟各组织中溶菌酶活性的变化

从表3可见：溶菌酶活性在施氏鲟肠中较高；3种中草药作用下的施氏鲟血清中溶菌酶活性与对照组相比均有所增强；肝中溶菌酶活性最高值出现在甘草-高温组，为(4.58±0.87)μg/g，且显著高于其他组(P<0.05)；幽门盲囊中溶菌酶活性较高，黄芪-高温组幽门盲囊中溶菌酶活性最高,且显著高于其他组(P<0.05)；胃中黄芪作用下的施氏鲟溶菌酶活性显著高于对照组(P<0.05)；肠中溶菌酶活性整体偏高，3种中草药作用下的施氏鲟肠中溶菌酶活性均显著高于对照组(P<0.05)；鳃中3种中草药作用下的施氏鲟溶菌酶活性与对照组相比均显著升高(P<0.05)。

表3 中草药对施氏鲟各组织中溶菌酶活性的影响Tab.3 Effects of Chinese herbal medicines on lysozyme activities in different tissues and organs of the Amur sturgeon

3 讨论

鱼类是一种具有特异性免疫和非特异性免疫的低等脊椎动物，非特异性免疫对防止病原体入侵起着重要作用[20]，具有维护机体健康的重要特性。适度的应激对鱼类机体有一定益处，但是长时间处于应激状态则会破坏鱼类的免疫系统，皮质类固醇的浓度会随着一系列的反应而增加[21]。

3.1 3种中草药对施氏鲟血清中蛋白含量的影响

水产动物血清中总蛋白含量的变化与肝脏代谢情况密切相关，当鱼类体内总蛋白含量升高时，白蛋白和球蛋白的含量会随之增加，鱼类体内免疫因子则有所增加[22]。血清中总蛋白含量的升高,可能是因为机体大量吸收营养物质，代谢加快，蛋白质合成旺盛，分泌到血液中的蛋白质增多而导致的[23]。白蛋白是血液中含量最多、功能比较复杂的一种蛋白，对维持机体正常的生理功能具有重要意义。血浆中球蛋白含有的γ-球蛋白可以促进鱼类机体的免疫功能[24]。本研究表明，常温条件下，甘草、茯苓对施氏鲟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量均有提升作用，这表明甘草、茯苓可有效增强施氏鲟免疫功能。高温热应激条件下，黄芪、甘草、茯苓组与对照组相比蛋白含量均有提高，表明黄芪、甘草、茯苓对施氏鲟抗热应激作用起到一定效果。王荻等[25]自组的中草药方剂复方A对施氏鲟血浆中蛋白含量有一定提高作用，可有效提高鱼体免疫力，这与本研究结果相似。

3.2 3种中草药对施氏鲟白细胞吞噬功能的影响

白细胞能够吞噬动物体内衰老及死亡的细胞和大量的病原微生物。白细胞吞噬活性在一定程度上可以体现出机体的免疫水平[26]。本研究表明，在常温条件下，黄芪、甘草、茯苓对白细胞吞噬指数均有一定增强作用，高温应激条件下，黄芪、茯苓可显著提高施氏鲟白细胞吞噬指数。常温条件下，茯苓对施氏鲟吞噬细菌数无提升作用，而高温应激条件下，茯苓可有效提高吞噬细菌数。这表明，3种中草药均可一定程度上增强施氏鲟白细胞吞噬功能，而黄芪、茯苓可促进施氏鲟对高温热应激迅速做出应答。

3.3 3种中草药对施氏鲟相关组织中溶菌酶活性的影响

溶菌酶是一种水解酶，在血清中主要存在于中性粒细胞、单核细胞和吞噬细胞。溶菌酶可以水解细菌细胞壁，使细菌细胞内部渗透压不同而破裂。溶菌酶就是通过此途径来杀灭病原微生物[19]。溶菌酶对鱼类来说是较重要的防御因子，可以反映鱼类的健康受到哪些病原菌及外界因素的影响[27]。血清中溶菌酶活性与循环系统中白细胞数目呈正相关，白细胞数目多，溶菌酶活性就增加[28]。因此，其活性是决定吞噬细胞杀灭病原菌能力的决定性因素之一[29-30]。本研究表明，常温条件下，黄芪、甘草、茯苓对施氏鲟血清、幽门盲囊、胃、肠、鳃中溶菌酶活性均有一定增强作用。高温热应激条件下，黄芪仍对施氏鲟血清、幽门盲囊、胃、肠、鳃中溶菌酶活性有提高作用。表明黄芪在促进施氏鲟对高温应激做出有效应答上有较好的作用。

4 结语

本试验中选取的3种中草药对施氏鲟血清蛋白含量、白细胞吞噬能力和部分组织中溶菌酶活性均有一定提高和促进作用，其中黄芪可能对鱼体抗热应激起到一定作用。