刘东红，林峰，杨再兴，张振成，仲人前，梁艳

（1.台州市第一人民医院 温州医科大学附属黄岩医院 检验科，浙江 台州 318020；2.台州市第一人民医院 温州医科大学附属黄岩医院 普外科，浙江 台州 318020；3.上海长征医院 实验诊断科，上海200003）

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种慢性、胆汁淤积性、自身免疫性肝病，其病理学特征是肝内胆管上皮细胞（intrahepatic biliary epithelial cell，IBEC）的炎症损伤，但病因和发病机制未明。研究表明泌尿道感染与PBC密切相关[1]，泌尿道感染主要由革兰氏阴性菌引起，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是其细胞壁主要成分，LPS也是Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）的天然配体，因此，我们推测TLR4通路的异常活化可能在PBC的发生发展中具有重要作用，且TLR4在PBC患者外周血和肝组织中的表达均明显上调，提示PBC中确实存在TLR4通路异常[2-4]。但TLR4与PBC的IBEC损伤的关系国内外鲜有报道。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一种上皮细胞向间质细胞转化的现象，在肿瘤转移和纤维化疾病中起重要作用。研究显示，胆管细胞在TGF-β等细胞因子刺激下会发生EMT，可能促进先天性胆道闭锁等胆汁淤积性肝病肝纤维化的发生发展[5]。而且，在PBC患者肝移植术后复发的肝组织中也发现了胆管细胞的EMT[6]。这些结果提示，PBC患者IBEC有发生EMT的可能，从而有助于PBC从炎症向纤维化发展。本研究通过免疫组织化学检测了PBC肝组织中TLR4和IBEC的EMT标志物的表达情况，并探讨了二者的相关性及与PBC进展的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 收集上海长征医院就诊的PBC患者11例（PBC组），男3例，女8例，年龄（48±13）岁，诊断均符合美国肝病学会提出的最新PBC诊断指南，且所有患者均进行了肝组织活检。其中，肝组织学表现为PBC I期2例， II期3例， III期2例，IV期4例。同时收集5例肝移植供肝者肝组织切片标本作为正常对照组。其中，男3例，女2例，年龄（50±12）岁，HE染色显示肝脏无任何病变。本研究经上海长征医院伦理委员会批准。

1.2 试剂和仪器 兔抗人TLR4抗体购自武汉博士德生物公司；小鼠抗人波形蛋白Vimentin抗体、兔抗人E-钙黏蛋白即用型抗体、小鼠抗人细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）即用型免疫组织化学单克隆抗体以及即用型免疫组织化学Elivision plus试剂盒（鼠/兔）、DAB显色试剂盒和苏木素体细胞快速染液均购自福州迈新公司；普通光学显微镜为日本奥林巴斯公司产品。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色：将常规4%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋好的肝组织块制成厚3 μm的切片。采用链霉素-过氧化物酶免疫组织化学方法染色，其中TLR4一抗按1:100稀释，其他抗体为即用型。采用DAB液显色。

1.3.2 阳性细胞计数：在显微镜下观察切片，对每例切片随机选取5个视野，以IBEC出现棕黄色或棕褐色颗粒，特异性分布于胞浆或胞膜者为阳性，计算阳性表达率。公式为：阳性表达率＝阳性染色细胞数/IBEC数×100%。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS10.0软件进行统计。各组间阳性表达率比较采用χ2检验，两两比较采用χ2分割法，多组小样本量的计量资料的比较采用Kruskal-Wallis H检验，各标志物阳性表达率之间的相关性采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CK19在PBC患者肝组织中的表达 CK19在正常对照组及PBC组IBEC中均有表达，且阳性率随着PBC分期增高而明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 TLR4在PBC患者IBEC中的表达 TLR4蛋白在正常对照组IBEC中几乎无表达，在PBC组IBEC胞膜上表达，各期PBC患者TLR4表达平均阳性率分别为I期28.6%、 II期41.6%、 III期64.1%、IV期73.1%。两两比较的结果显示，除I期与 II期及 III期与IV期外，其余各组间阳性细胞数差异均有统计学意义（P＜0.01），见图2。

2.3 上皮细胞标志E-钙黏蛋白在PBC患者IBEC中的表达 E-钙黏蛋白在正常对照组IBEC胞膜和胞浆中表达，而在PBC组IBEC中表达明显降低，各期PBC患者E-钙黏蛋白平均阳性率分别为I期84.0%、 II期48.1%、II 期23.0%、IV期19.0%，两两比较结果显示，除正常对照组与I期及 III期与IV期外，其余各组间阳性细胞数比较差异均有统计学意义（P＜0.01），见图3。

图1 肝组织门管区CK19表达

图2 肝组织中TLR4表达情况

图3 肝组织E-钙黏蛋白表达

2.4 Vimentin在PBC患者IBEC中的表达 Vimentin在正常对照组IBEC几乎无表达，在PBC组IBEC胞浆表达明显，各期Vimentin平均阳性率分别为I期30.0%、 II期40.1%、 III期73.7%、IV期77.0%。两两比较结果显示，除I期与II期以及III期与IV期外，其余各组间阳性细胞数差异均有统计学意义（P＜0.01），见图4。

图4 肝组织Vimentin表达

2.5 PBC患者IBEC TLR4阳性表达率与EMT相关蛋白阳性表达率的相关性 PBC患者IBEC TLR4表达与E-钙黏蛋白呈显著负相关（r=-0.927，P＜0.001），与Vimentin呈显著正相关（r=0.918，P＜0.001），E-钙黏蛋白表达与Vimentin呈显著负相关（r=-0.918，P＜0.001），见图5。

3 讨论

有研究发现TLR4在PBC患者外周血[7]和肝组织中的表达明显上调[2-4]，而且TLR4通路在PBC中是异常活化的[8-9]。本研究也发现TLR4在PBC患者肝组织IBEC中的表达显著上调，且其表达随PBC纤维化、硬化程度加重而显著增加。这提示TLR4的异常升高可能参与了PBC由炎症向纤维化、硬化发展的过程。但TLR4参与PBC由炎症向纤维化、硬化发展的具体机制国内外尚未见相关报道。

PBC的发展过程通常是一种由慢性炎症向纤维化、硬化逐渐过渡的缓慢进程。在此过程中，IBEC逐渐减少。但IBEC减少的原因以及这种减少与PBC由炎症向纤维化发展有何关系，尚不完全清楚。在先天性胆管闭锁等胆汁淤积性肝病以及胆管结扎术大鼠中的IBEC存在EMT现象[5]。而且，在PBC患者肝移植术后复发的肝组织中也发现IBEC的EMT现象[6]。本研究进一步证实，PBC的IBEC确实发生了EMT，即IBEC由上皮细胞逐渐转化为间质细胞甚至成纤维细胞，而且，EMT随着PBC纤维化、硬化的加重而愈发明显。这些结果提示，PBC中由于IBEC发生EMT而使自身逐渐减少，同时有助于PBC由炎症向纤维化、硬化发展。

图5 PBC患者IBEC EMT相关标志物的相关性

本研究结果还表明，PBC患者IBEC中TLR4的表达与IBEC发生EMT密切相关。已有文献报道TLR4信号通路活化可以诱导肾小管上皮细胞[10]、肝癌细胞[11]、胃癌细胞[12]等多种细胞发生EMT。综合这些结果，可以推测，在PBC中，IBEC的TLR4通路异常活化，有助于诱导IBEC发生EMT，从而出现了IBEC的持续减少直至消失。也正是由于IBEC通过EMT向间质细胞或成纤维细胞转化，引起了PBC由炎症向纤维化、硬化发展。但这一推测还有待于进一步通过细胞实验或体内实验进行验证。