杨世平，周嘉豪，孙成波，曹佩星，王成桂，陈兆明，罗 鹏

( 1.广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088； 2.广东省应用海洋生物学重点实验室，广东 广州 510301 )

近年来，随着水产养殖行业的快速发展，不少养殖品种均面临着品种老化和退化、养殖动物病害的频繁发生、养殖水体环境的日益恶化三大问题，已成为阻碍我国水产养殖业发展的瓶颈[1]。虾池内的总氮量约有90%为人工投饵造成，其中只有19%转化为虾体内的氮，有62%～68%的氮沉积于淤泥中，有8%～12%是以溶解氮等形式存在于池水中。这些污染物或沉积到虾池底部，或直接排入养殖环境中，导致环境的污染越来越严重，养殖过程中的病害也越来越难控制[2]。在养殖生产中，往往使用消毒剂或抗生素来进行疾病的预防和控制，造成了生物抗药性的增加和药物残留等问题[3]。而微生物制剂的绿色环保、无残留、不产生抗性和作用广泛等优点，已成为当代水产养殖中抗生素等化学药剂最有潜力的替代品[3-5]。同时，微生物制剂还具有降低水体中氨氮、亚硝酸盐等有毒物质，调控对虾养殖水体水质，稳定藻相的作用，为对虾的养殖成功提供一个良好的水环境[6]。

芽孢杆菌(Bacillus)是人类发现最早的细菌之一，它在工业酶、生物防治和微生物添加剂等领域已有很多的研究和应用。芽孢杆菌作为一种微生物制剂，在水产养殖中的应用已有诸多报道。具有清除各种有机污染和氨氮等有毒物质的作用，也可产生抗菌素等抑制有害细菌的生长，改善水产动物肠道微生物群落结构，提高免疫力、消化酶活力和成活率等[6-15]。乳酸菌具有产生乳酸、调节微生物菌群、维持微生态平衡等作用[16]。而产乳酸的芽孢杆菌具有乳酸菌和芽孢杆菌的特点，已被用于断奶仔猪中，能提高断奶仔猪的日增质量和血清中的白蛋白和总蛋白含量，增强仔猪的免疫力[17]。目前，关于产乳酸芽孢杆菌在对虾养殖中的应用尚未见报道。因此，笔者使用不同密度的产乳酸芽孢杆菌直接投入对虾养殖后期水体中，研究其对养殖水体水质的影响，以期为产乳酸芽孢杆菌的使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

产乳酸芽孢杆菌由广东八方生物科技有限公司提供，含量为2.0×1010cfu/g；凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)取自广东海洋大学东海岛海洋生物基地，选取(9.0±0.8) cm同一批次健康、活力好的凡纳滨对虾，暂养3 d 后进行试验。

1.2 试验设计

模仿室外池塘养殖，试验在0.3 m3的玻璃钢桶中进行，装入养殖后期海水200 L，每个试验桶放入10尾凡纳滨对虾。试验分为对照组和3个试验组，各组分别投放芽孢杆菌0、0.1、1、10 g，使投放的芽孢杆菌的密度为0、104、105cfu/mL和106cfu/mL，每组设3个平行。所有的试验桶均实行同样的管理措施。每日测量一次水质和总异养菌、弧菌(Vibrio)以及芽孢杆菌的变化，持续7 d，期间不进行换水处理。试验水体盐度28，温度(28±1) ℃，pH 8.0±0.2。

1.3 水样的采集及指标测定

采样时间为每日8:30，采样后直接带回实验室进行测定。氨氮采用改良的次溴酸钠氧化法分光光度法测定[18]，亚硝酸盐氮采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定，硝酸盐氮采用锌镉还原法测定，活性磷(可溶性活性磷)采用磷钼蓝法测定[19]。总异养菌、弧菌及芽孢杆菌分别采用2216E 培养基、硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基和营养琼脂培养基，用稀释涂布平板法测定[20]。芽孢杆菌测定时，水样需要80 ℃的水浴20 min。30 ℃恒温培养24～72 h后，计数菌落数量。

1.4 数据处理与分析

使用Excel、SPSS软件进行数据的统计分析，并在0.05水平上对结果进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌对对虾养殖水体中理化因子的影响

2.1.1 氨氮

图1 养殖水体中氨氮的变化同一时间的柱形图中不同小写字母表示差异显著，下同.

试验期间水体中的氨氮含量情况见图1。投放芽孢杆菌后，104、105cfu/mL密度组水体中氨氮含量先出现增加趋势，到第3 d时，氨氮含量显著高于对照组(P<0.05)。各试验组第6 d和第7 d时，均出现小幅增加，但投放芽孢杆菌的各试验组水体中氨氮含量显著低于对照组(P<0.05)。

2.1.2 亚硝酸盐氮

试验期间水体中的亚硝酸盐氮含量变化见图2。同氨氮含量变化一样，在第4 d时，各试验组的亚硝酸盐氮含量均有小幅下降，随后开始上升。至6 d时，各投放芽孢杆菌的试验组水体中亚硝酸盐氮含量达最高，随后开始下降。第7 d时，投放芽孢杆菌的各试验组水体中亚硝酸盐氮含量显著低于对照组(P<0.05)。

图2 养殖水体中亚硝酸盐氮的变化

2.1.3 硝酸盐氮

试验期间水体中的硝酸盐氮含量变化见图3。投放芽孢杆菌的各试验组水体中硝酸盐氮含量变化规律与氨氮、亚硝酸盐氮相似。在第4 d时，各试验组的硝酸盐氮含量均有小幅下降，但随后又开始增加。除第1 d以外，投放芽孢杆菌的各试验组水体中硝酸盐氮含量与对照组间均无显著差异(P>0.05)。

图3 养殖水体中硝酸盐氮的变化

2.2 芽孢杆菌对对虾养殖水体中微生物的影响

2.2.1 总异养菌

水体中总异养菌的变化见图4。各投放芽孢杆菌的试验组总异养菌的密度从试验一开始均高于对照组，到第4 d时，各投放芽孢杆菌的试验组总异养菌密度达到最高，且均显著高于对照组(P<0.05)。到第5 d后各投放芽孢杆菌的试验组的总异养菌密度开始减少。到第7 d时，只有106cfu/mL密度组的总密度高于对照组。

2.2.2 弧菌

水体中弧菌的变化见图5。在投放芽孢杆菌第2 d和第3 d，各投放芽孢杆菌的试验组弧菌密度与总异养菌密度一样，达到最高且均显著高于对照组(P<0.05)。试验期间仅有第7 d，对照组弧菌密度显著高于各投放芽孢杆菌的试验组(P<0.05)。

图5 水体中弧菌的变化

2.2.3 芽孢杆菌

投放芽孢杆菌的各试验组水体中芽孢杆菌的变化见图6。投放芽孢杆菌后，各试验组芽孢杆菌的密度呈现一个上升的趋势，到第4 d时，各投放芽孢杆菌的试验组芽孢杆菌的密度达到最高，第4 d后开始下降。第6 d时，各试验组芽孢杆菌的密度差异缩小，105cfu/mL和106cfu/mL间的芽孢杆菌的密度无显著差异(P>0.05)。各投放芽孢杆菌组的芽孢杆菌密度在整个试验期间均显著高于对照组(P<0.05)。

图6 水体中芽孢杆菌的变化

3 讨 论

3.1 芽孢杆菌对对虾养殖水体理化因子的影响

芽孢杆菌是普遍存在的一类好气性细菌[18]，它也是水产养殖中一种常见的微生物制剂，可以分解养殖过程中残留的各种废物，有效降低养殖水体中的化学需氧量和生物需氧量，以及氨氮和亚硝酸盐氮等有害物质的含量，同时为单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进水质各种营养物质的良性生态循环[1,6,21-23]。在本试验中，投放芽孢杆菌的各试验组在试验结束时，养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐氮的含量均显著低于对照组(P<0.05)，说明芽孢杆菌能有效去除养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐氮。与使用枯草芽孢杆菌制剂来改善罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[24]、鳜鱼(Sinipercachuatsi)[25]等养殖水体水质的试验结果相似。试验中还发现，在投入芽孢杆菌后的第3 d，104cfu/mL和105cfu/mL试验组的氨氮含量显著高于对照组(P<0.05)，原因可能为本试验模拟了室外池塘养殖条件，用养殖后期的池塘水作为试验用水，养殖水体中各种有机废物的本底含量较高，投入芽孢杆菌后，加速了各种有机废物的分解，从而导致氨氮含量的短暂升高。杭小英等[24]研究枯草芽孢杆菌制剂对罗氏沼虾养殖池塘水质的影响，出现了类似的结果。这也提示在使用芽孢杆菌等微生物制剂时，需要长期有规律的使用，如果在养殖水体中有机物积累较多才使用，会有导致氨氮含量短暂升高的风险。

3.2 芽孢杆菌对对虾养殖水体中微生物的影响

养殖水体中微生物的主要种类包括一些对水环境有益的微生物，如芽孢杆菌、亚硝化菌、乳酸杆菌，也包括一些有害的微生物，如副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)等[26]，它们组成了一个动态平衡系统，这种平衡一旦被打破，有害细菌的大量繁殖，就会导致养殖对象产生疾病。本试验采用对虾养殖后期池塘水进行试验，水体的总异养菌、弧菌和芽孢杆菌的密度较高，分别达107～108cfu/mL、104～105cfu/mL和102～104cfu/mL。总异养菌、弧菌的密度与测定的凡纳滨对虾苗种淡化期间养殖水体密度相近[27]，高于李卓佳等[20]测定的高位池养殖水体中的密度。试验中，投入芽孢杆菌后，水体的总异养菌和芽孢杆菌的密度均显著增加(P<0.05)。在试验结束时，水体中弧菌的密度也显著低于对照组(P<0.05)，说明投放的芽孢杆菌能在养殖水体中存活和繁殖，结合水质数据指标，起到了改善水质的作用。但在投入芽孢杆菌后的第2 d和第3 d，水体中弧菌密度却显著高于对照组，与王春迪等[14,28]的研究结果不同。硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基能够培养养殖水体中的弧菌，但部分非弧菌的细菌也能在其上良好生长[29]。因此，养殖水体的弧菌密度的增加可以有两个原因。一是检测方法的不准确，总异养菌的增加，一些非弧菌细菌因有硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基而生长。二是因为本试验采用的是养殖后期池塘水作为试验用水，芽孢杆菌的添加，加速水体中有机营养物的释放，从而导致弧菌密度的短期升高，具体原因有待进一步研究。