邢 玮，王政霖，王宏亮，吕甜甜，吴 晏，王 伟，韩 静

（北京中医药大学，北京 100029）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是当今全球成人眼盲的主要发病因素之一，为糖尿病晚期眼部最常见的并发症，主要为血管病变[1]。因此，在治疗糖尿病过程中，DR 不容忽视。 糖尿病视网膜病变的发生发展与多种信号通路失常有关。近年来，Notch 信号通路在糖尿病肾病的研究中得到了重视，但其在 DR 中的作用机制尚未明确。Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导通路，介导细胞之间的直接接触，能够在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥调控作用。Notch1 为 Notch信号通路中的受体，Delta 样配体 4（Dll4）是 Notch1 的配体，Hes1 是 Notch信号通路中极其重要的靶基因。Notch 信号通路中的配体和其受体相互结合，是诱导 Notch 受体构象发生改变的原因，由 γ -分泌酶介导，释放出来 Notch 胞内域（Notch intracellular domain，NICD），其作为 Notch受体活化的形式，在其进入到细胞核后，激活下游的基因 Hes，帮助细胞转归，诱导其分化[2]。因此检测Notch1、Dll4 和 Hes1 的表达水平可以反应 Notch 信号通路的变化。DR在中医范畴属“消渴目病”，发病过程复杂[3]。活血解毒方为临床经验方，主要由三七、鬼箭羽和黄连等组成。经前期实验得出，活血解毒方可降低糖化血红蛋白[4]，改善视网膜中央动脉血流状况，降低视网膜血管密度，减少内皮细胞与周细胞的比例[5]，但是其药理机制尚未阐明。本实验通过建立糖尿病大鼠模型，观察糖尿病及活血解毒方对视网膜组织中Notch信号通路产生的作用，探寻糖尿病视网膜病变发展中 Notch 产生的意义，同时揭示活血解毒方对于防治DR的药理机制。

1　实验材料

1.1动物 SPF级的雄性SD大鼠共18只，周龄为7周，体质量165～200 g,购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号编号为SCXK（京）2012-0001。饲养在北京中医药大学和平街校区实验动物中心，实验室相对湿度保持在 50%～70%，室内温度保持在20～25 ℃，换气次数10～15次/h，维持12 h/12 h光照黑夜，适应性喂养为期1周。

1.2药物 链脲佐菌素（streptozotocin, STZ，S0130，Sigma公司产品，美国），溶解在柠檬酸钠溶液中（0.1 mmol/L，pH 4.2～4.5），在冰盒中现用现配；活血解毒方由北京中医药大学中药学院提供。

1.3实验仪器 BCA蛋白定量试剂盒（Prod#23228，Thermo公司产品，美国），蛋白垂直电泳和转膜系统、凝胶图像分析系统（BIO RAD公司产品，美国），增强型化学发光检测试剂盒（RPN2232，GE Healthcare公司产品，美国），荧光倒置显微镜（奥林巴斯株式会社产品，日本），Hes1多克隆抗体（ab71559）、Notch1多克隆抗体（ab52301）及Dll4多克隆抗体（ab183532）购自英国Abcam公司。

2　实验方法

2.1大鼠分组和造模 构建糖尿病模型组，在实验动物中心饲养SD 大鼠1周后，对大鼠禁食12 h，随机选择 12 只大鼠，腹腔一次性注射 STZ（65 mg/kg，溶剂为0.1 mmol/L柠檬酸钠溶液，冰浴）。设立正常对照组，取6只大鼠腹腔注射等量的0.1 mmol/L浓度的柠檬酸钠溶液。给药7 d后进行糖尿病模型结果检测，对大鼠禁食 6 h 后，尾静脉采血，血糖≥16. 7 mmol/L认定为造模成功。饲养20周后，根据体质量、血糖采用数字表法将造模成功的大鼠分为模型组、给药组。灌胃给药12周，给药组每日7. 7 g/kg（为临床用量7倍）；正常组和模型组给予等体积蒸馏水。

2.2检测方法与检测指标

2.2.1免疫组化处死大鼠后，取眼球在4% 的多聚甲醛溶液中固定，需要采用LSAB法，多克隆抗体浓度为Notch1（1：50）及Dll4（1：100）。常规石蜡切片脱蜡，从高到低浓度梯度酒精水化；自来水冲洗10 min，PBS 5 min洗3次，3% H2O2氧化15 min后，自来水冲洗10 min，PBS 5 min洗3次；4℃ 湿盒孵育一抗（多克隆抗体Notch1及Dll4）12 h，PBS 5 min洗3次；室温湿盒孵育二抗2 h；PBS 5 min洗3次；DAB显色，自来水反复冲洗；随即苏木素复染30 s，自来水冲洗10 min ；从低到高浓度梯度酒精脱水，二甲苯溶液透明 15 min 2次后，滴加中性树脂封片，用荧光倒置显微镜并使用Image-Pro-Plus 6.0软件观察、拍照及数据分析，需得出Notch1以及Dll4 的积分光密度值（integral optical density，IOD）。

2.2.2Hes1 蛋白表达水平的检测 使用 Western blot 的方法，在大鼠的视网膜组织加入预冷的 RIPA 裂解液，匀浆，在高速离心机15 000 r/min、4 ℃离心20 min，弃下层物质取上清，采用 BCA 法检测蛋白浓度。然后SDS-PAGE 电泳分离蛋白，电转移至 PVDF 膜，在含5%脱脂奶粉的 TBST 中室温封闭2 h后，需要 TBST 漂洗3次，每次10 min，然后加入一抗，在 4 ℃ 条件下孵育过夜；然后 TBST 漂洗3次，每次10 min，再次加入二抗，室温放置 2 h；滴加ECL发光液于PVDF膜上，通过化学发光检测目的条带，利用凝胶图像分析仪及Image Lab软件分析PVDF膜上条带，以目的蛋白/β-actin比值为目的蛋白表达相对水平。

2.3数据统计 使用统计学方法，SPSS 20.0软件数据分析，以均数±标准差（± s ）的形式表示数据，采样one-way ANOVA法，比较多样本均数，P＜0.05视为具有统计学意义。

3　结果

3.1活血解毒方对 Notch1、Dll4 表达的影响 由免疫组化的结果可以看出，正常组中 Notch1 主要分布于视网膜神经节层与内网层 ；模型组中 Notch1 在视网膜神经节层、内网层、内核层、外核层、色素上皮细胞层均有所表达，Notch1 的含量高于正常组（P＜0.05）；活血解毒方组与正常组分布近似，Notch1 表达水平少于模型组（P＜0.05）。正常组视网膜中 Dll4 在神经节层、内网层、内核层及色素上皮细胞层中表达，模型组与活血解毒方组均表达在视网膜神经节层、内网层、内核层、外核层、色素上皮细胞层中，模型组 Dll4 表达水平高于正常组（P＜0.05），活血解毒方组 Dll4 表达水平少于模型组（P＜0.05）。见表1，图1～2（插页一）。

表 1 各组大鼠视网膜中Notch1、Dll4表达比较（± s ，n = 6）

表 1 各组大鼠视网膜中Notch1、Dll4表达比较（± s ，n = 6）

注：放大倍数400倍；与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　Notch1　Dll4正常组　0.1606±0.02295　0.2139±0.02281模型组　0.4175±0.1616#　0.2499±0.02259#活血解毒方组　0.1207±0.4869△　0.2175±0.02438△

3.2活血解毒方对 Hes1表达的影响 用 Western blot法检测正常组、模型组、活血解毒方组视网膜组织中Hes1 表达水平，与正常组相比，模型组的Hes1 表达上调（P＜0.05）；与模型组相比，活血解毒方组 Hes1表达下调。见图3。

图3　活血解毒方对Hes1蛋白表达水平的影响

4　讨论

Notch 信号通路是一条在进化上高度保守、广泛存在的，调节后生动物体内相邻细胞间的直接信号传导的信号通路。在1917年，Morgan 等人在果蝇体内首次发现了 Notch 基因；在1983年，成功的克隆出了该基因，并发现其可以编码跨膜受体，命名为 Notch 受体[6]。随后多年的研究发现，在多种物种中存在Notch信号，例如无脊椎动物、哺乳动物等。

Notch 信号通路主要由3部分构成，分别为受体、配体及细胞内效应器分子CSL-DNA结合蛋白。在哺乳动物体内，目前已经可以检测出4种 Notch 受体的同源基因（ Notch1-4 ）和5种配体 （Jagged1和2，和Delta-like1、3和4）。Notch 信号产生是通过细胞受体与配体间相互作用，经剪切后，胞内段（NICD）释放至细胞质，由胞质进入核内，结合转录因子CSL，形成转录激活复合体，激活下游转录抑制因子家族的靶基因，如Hes、Hey、Herp 等，促进该通路的生物学作用[7]。最终影响了细胞的分化和增殖以及凋亡。

Notch信号通路对血管形成、发育及生理功能等方面产生重要作用。研究表明，基因敲除 Notch 1和/或Notch 4 的纯合子小鼠均在胚胎期10.5 d因为严重的血管发育缺陷死亡，例如卵黄囊发育不良、大量的胚胎期出血、扩大的心包囊结构、胎盘发育受损等[8～12]。另外有研究证明，Notch 信号缺失小鼠可观察到大量血管生成，但是却伴随着严重的血管渗漏和出血，提示缺失 Notch 信号会导致血管功能严重受损[13]。

视网膜内有大量血管，因此 Notch 信号通路对视网膜内血管的形成发挥重要作用。Dll4 仅在血管内皮细胞中表达，Notch / Dll4 能抑制新生血管的内皮细胞向尖端细胞（ tip cell ）分化。在抑制 Notch 的活性或者敲除 Dll4 的小鼠中，视网膜血管内皮细胞分化后，导致尖端细胞过多生长，进而显著促进毛细血管网的出芽、分枝以及融合[14-15]。虽然 Notch 信号通路影响视网膜血管形成，但其作用于糖尿病视网膜病变机制并无科学阐释。本实验通过免疫组化发现，正常组视网膜组织中 Notch 信号通路成员仅见少量表达，而在糖尿病视网膜病变组织中 Notch 信号通路配体 Dll4 和受体 Notch1 表达增加。Western blot 结果表明，下游基因 Hes1 的蛋白含量在糖尿病视网膜病变组织中较正常组明显增强。糖尿病视网膜病变发展过程复杂，其中由于高血糖与低氧环境的双重持续刺激作用，可能会导致 Notch 信号通路被激活，促进其成员 Notch1 和Dll4 以及 Hes1 的合成与释放得到增多，从而对病变的发生发展起促进作用。

本实验进一步分析了活血解毒方对 Notch 信号通路的影响，结果发现与模型组比较，活血解毒方组降低 Notch1、Dll4、Hes1 的含量，提示活血解毒方改善糖尿病大鼠视网膜病变可能与干预 Notch 信号通路有关。前期课题组曾证实，活血解毒方促进色素上皮衍生因子的水平[16]，抑制了血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、 血 管 紧 张 素 Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）及内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）的表达[17]。有文献报道，肾细胞癌内皮细胞中 VEGF 可增加 Dll4 基因及蛋白水平的表达[18-19]。另外 AngⅡ 刺激小鼠足细胞或血管平滑肌细胞后，可使Notch 通路被激活，Notch1 的活化形式 NICD1 及其下游基因 Hes1 表达增加[20]；而阻断 AngⅡ 后，Notch 通路则被抑制[21]。至今已经知道的内源性缩血管物质中ET 是最强的，能够促进血管收缩，加速平滑肌细胞增殖[22]；在星形胶质细胞中，ET-1 可促进 Jagged1 表达，调节 Notch 激活[23]。综合文献及本课题组的实验结果，笔者推测在 DR 的发病发展过程，VEGF、AngⅡ、ET-1 可能通过调控了 Notch 信号通路来影响内皮细胞的增殖或分化，因此导致了新生血管的形成；而活血解毒方可能由于抑制了 VEGF、AngⅡ、ET-1 而阻断Notch 信号通路，减少了新生血管的生成，从而延缓DR 的进程。但是这种设想仍需进一步实验验证。

本实验阐述了活血解毒方对 Notch 信号通路的作用，有助于揭示活血解毒方的药理机制，为活血解毒方临床治疗 DR 提供可靠的实验依据。但是 Notch信号通路的作用机制十分复杂，Notch 信号通路中的Jagged1、 NICD1 与 DR 的关系亟需深入研究，这对阐明 DR 的发病机制，探寻新的治疗靶点具有重要意义。