许零　马晓春　曾莉君

[摘要] 目的 初步评价复合大孔聚多糖止血材料的止血效果，研究其体外性能。 方法 辐照交联法制备复合大孔聚多糖止血材料，通过红外及理化测试表征材料的结构、降解性能及凝血性能。 结果 止血材料经辐照后分子发生交联，吸水率达3456%；体外降解实验表明，止血材料降解性能良好，在溶菌酶溶液中3 d即可降解68%，20 d内则降解完全；材料的体外凝血时间为（25.33±2.45）s，能吸附更多的红细胞和血小板，血凝块强度更大。 结论 辐照交联技术制备的复合大孔聚多糖止血材料具有较好的吸液性能和凝血性能，在伤口止血方面具有良好的应用前景。

[关键词] 辐照交联；羧甲基壳聚糖；止血材料；体外降解；凝血

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（b）-0017-04

Preparation of the macroporous polysaccharide hemostatic complex materials and study on its performance in vitro

XU Ling1 MA Xiaochun1 ZENG Lijun2 CHEN Miaoyuan2 WANG Yun2 JU Xuecheng1 QIU Ximei1

1.Peking University Shenzhen Institute， Guangdong Province， Shenzhen 518057， China； 2.Xiamen Gelfeel Biological Technology Co.， Ltd.， Fujian Province， Xiamen 361026， China

[Abstract] Objective To evaluate the hemostatic effect of the macroporous polysaccharide hemostasis complex materials preliminarily， and to investigate the performance of the materials in vitro. Methods The hemostatic materials were prepared by γ-irradiation crosslinked method， and its structure， degradation in vitro and clotting performance were characterized by infrared spectrum and physicochemical test. Results The results showed that the crosslinked carboxymethylated-chitosan molecules had been made after the materials were irradiated， and its water absorption was of 3456%. The biodegradable degradation of the materials in lysozyme solution was 68% after 3 days and the degradation completed within 20 days. The clotting time was （25.33±2.45） s， which indicated the material adhered more red blood cells and platelets and showed the stronger blood clots. Conclusion The macroporous polysaccharide hemostasis complex materials prepared by γ-irradiation crosslinked method possess great solution absorption performance and blood coagulation performance， which has good application prospect in wound hemostasis.

[Key words] Radiation cross-linking： Carboxymethyl chitosan； Hemostatic material； Degradation in vitro； Blood coagulation

大多意外死亡均是由于未及時止血导致失血过多而引起的[1-3]。目前在临床中使用的止血方法主要是用外科手术，然而此方法无法进行大面积范围的止血，在止血过程中因使用器械而产生的热量会导致伤口及周围组织不必要的变形损伤[4]。因此，止血材料的研究至关重要。止血材料具有伤口止血、促进愈合的作用[5]，目前报道的快速止血材料主要有多孔沸石、植物淀粉类、氧化再生纤维素类、胶原类材料以及壳聚糖类等[6-13]，但在临床应用中可供选择的功能完善的止血材料种类较少，且存在体内难以降解、止血效果差、生物相容性差等缺点。在众多的止血材料中，壳聚糖类止血材料已被广泛用于制造药物载体、人工真皮、可吸收手术缝合线及防粘连材料等[14]。壳聚糖经羧甲基化形成的羧甲基壳聚糖衍生物由于其无毒、无刺激、可生物降解并且具有良好的生物安全性等天然特性[15-19]，使其渐渐成为科学研究的热点。此外，辐照交联作为一种新型技术，通过电子加速器产生的电子束或Co-60、γ射线辐照物质，产生的自由基引发聚合物分子交联，从而改变其分子结构及物理性能[20]。辐照技术一方面省去了加热步骤，避免因高温导致材料变性；同时避免了外源性有毒化学物质的引入，很大程度上降低了细胞毒性。本研究采用辐照交联结合冷冻干燥技术制备复合大孔聚多糖止血材料，通过红外及理化测试表征材料的结构、降解性能及凝血性能，初步评价复合大孔聚多糖可吸收生物材料在临床应用中的应用前景，为解决国内体内止血材料稀缺问题提供选择的可能。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰兔（来源：上海维通利华实验动物有限公司），雄性，（2.0±0.2）kg，5～6个月，普通级。实验动物合格证号：2007001105992。动物的使用已得到北京大学实验动物福利伦理审查工作委员会的批准，批准号：AAIS-XuL-1。试验期间给予标准饲料，供应充足，自由摄食，自由饮水，昼夜12 h交替光照，室温（20±2）℃中饲养。

1.2 仪器与试药

仪器：冷冻干燥机（LGJ-18A，北京四环科学仪器厂有限公司）；红外光谱仪[MPA，布鲁克（北京）科技有限公司]；扫描电子显微镜（S-4800，Hitachi High-Technologies Corporation）；高速台式离心机（TGL-16M，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；质构仪（TA.XT.plus，Stable Micro Systems，Ltd.）。

试药：溴化钾（天津市北辰方正试剂厂，批号：150902）；磷酸氢二钠（西陇化工股份有限公司，批号：150902）；叠氮化钠（山东西亚化学股份有限公司，批号：S7470）；氯化钙（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150119）等，试剂均为分析纯。溶菌酶（Aladdin，D1507040，≥8000 units/mg）、柠檬酸钠抗凝血剂（西陇化工股份有限公司，批号：151129）；抗凝剂与血液的比例为1∶9。

1.3 实验方法

1.3.1 辐照交联 采用辐照交联制备复合大孔聚多糖止血材料，羧甲基壳聚糖及定量明胶与水在合适温度下按一定比例混合均匀，利用电子加速器进行辐照交联。得到的水凝胶经冷冻干燥后获得新型的复合大孔聚多糖止血材料。辐照温度为20℃；吸收剂量为25 kGy。

1.3.2 红外光谱 将未辐照原料及辐照交联法制备的复合大孔聚多糖止血材料，粉碎成约0.15 mm的粉末，采用KBr压片法在400～4000 cm-1波数下测试其红外光谱图，观察交联前后羧甲基壳聚糖的分子结构。

1.3.3 吸水性能 取辐照交聯制备的复合大孔聚多糖止血材料（m0）适量，以1∶100浸渍于纯化水中，在（37±1）℃条件下浸渍一段时间后过滤，称取水凝胶样品（m），按式（1）、（2）分别计算材料的吸水率及吸水速率：

吸水率（%）= ×100（1）；

吸水速率=吸水率/吸水时间（2）。

1.3.4 体外降解 实验以含有一定浓度的溶菌酶的PBS溶液为复合大孔聚多糖止血材料的体外降解液，模拟止血材料用于体内的止血环境。精密称取适量的复合大孔聚多糖止血材料（称重，记为m1）按10 mg/mL溶解于PBS溶液中（pH 7.2～7.4），加入一定量的溶菌酶（8 kU/mg）及叠氮化钠，置于37℃烘箱中降解，一定时间后将降解液水浴，离心后去掉上清液，将未降解完全的止血材料在37℃烘箱中烘干，称重（m2），按式（3）计算降解率：

降解率（%）= ×100（3）。

1.3.5 体外凝血性能 血细胞黏附：取新鲜血液，于离心半径4 cm、1500 r/min条件下离心15 min，分离得到的含高浓度血小板的血浆和富红细胞血液，将止血材料均匀粘贴在膜上，与新西兰兔富含红细胞液（沉淀）及富血小板血液（上清液）按照一定比例混合，固定，PBS溶液反复洗涤，干燥后喷金，进行观察，选区软件对选区内细胞数目进行统计。凝血时间：将止血材料与新西兰兔新鲜血液按照一定比例混合，计时，振荡以充分接触，倾斜试管45°，当血液不随试管倾斜时为凝血态，停止计时，记录凝血时间。血凝块强度测试：将止血材料与新西兰兔新鲜血液按照一定比例混合，20 min后利用质构仪对血块压缩强度进行测试，测试速度=1 mm/s，压缩距离为0.5 mm。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 材料的结构

图1为复合大孔聚多糖止血材料与原料羧甲基壳聚糖的红外光谱图。图1A是未交联的原料羧甲基壳聚糖的红外图谱，由图1A可知，波数3449 cm-1的强宽特征峰为O-H和N-H的伸缩振动；2885 cm-1和1327 cm-1分别为C-H的伸缩振动和弯曲振动；1624 cm-1和1410 cm-1分别为-COOH的不对称和对称伸缩振动；1064 cm-1则为伯醇（-CH2OH）所生产的醚键（-C-O-C-）的伸缩振动。羧甲基壳聚糖经辐照交联后，由图1B可知，在3745 cm-1处振动峰消失，3449 cm-1的特征峰变钝变宽。此外，1624 cm-1处-COOH的不对称伸缩振动峰向高波数方向偏移至1647 cm-1。

2.2 材料的吸水性质

图2为复合大孔聚多糖止血材料的吸水率及吸水速率图。由图2可知，材料的吸液行为主要发生在前5 min。吸水率随浸渍时间的延长逐渐增大，在浸渍时间为30 min时吸水率高达3456%。

2.3 止血材料的体外降解性能

图3为辐照交联后复合大孔聚多糖止血材料的体外降解情况。在体外降解条件下，材料降解率随着降解时间的延长而逐渐增加，在模拟体外降解条件1 d后降解率不小于50%，3 d降解68%，止血材料在前3 d降解速率较快，大部分被降解，200 mg的止血材料在20 d已能被完全降解。

2.4 止血材料的凝血性能

研究比较低温辐照交联制备的止血材料及常温组材料的血细胞黏附情况，见图4。低温组的止血材料比常温组吸附了更多的红细胞和血小板，其中，红细胞吸附数量约为常温组的2.5倍，而血小板的吸附则高达6倍。低温组和常温组样品红细胞吸附数量和血小板吸附数量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。凝血时间及血块强度数据如表1所示，辐照交联后制备的止血材料的凝血时间明显短于空白样品，血块强度明显大于空白样品，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

羧甲基壳聚糖分子经辐照后，在3745 cm-1处振动峰消失，3449 cm-1的特征峰变钝变宽，表明辐照后分子中的-OH基团减少，分子形成氢键，继而发生缔合作用，1624 cm-1处-COOH的不对称伸缩振动峰向高波数方向偏移至1647 cm-1，表明-COOH官能团的化学键增强。因此，羧甲基壳聚糖分子经辐照后已成功交联。辐照交联复合大孔聚多糖止血材料通过吸收血液中的水分及周围体液导致其孔隙结构几乎被液体所填满。止血材料的吸水过程主要在前30 min内完成，这是伤后出血的黄金救援期时间，对伤口止血具有重要意义。复合大孔聚多糖止血材料高的吸水率表明该止血材料拥有大的吸水容量、极强的吸液能力，使其止血效果更显著。材料的吸液行为主要发生在前5 min，这是由于在与水溶液接触最开始的5 min内吸水速率最快，即材料与液体接触后能够短时间内迅速吸收液体，这有利于止血材料迅速吸收血液中的水溶液，继而促进凝血，随着浸渍时间的延长，材料的吸水率增加缓慢，吸水速率减慢。机体血液及体液中含有大量的溶菌酶，而溶菌酶能够水解壳聚糖中的β（1～4）糖苷键，这对壳聚糖进入体内后的降解起到极其重要的作用。因此表征壳聚糖在体外溶菌酶溶液中的降解效率，在一定程度上可以说明壳聚糖在机体内的降解情况。由体外降解实验可知，止血材料在3 d即可降解68%，20 d内即降解完全。止血材料凝血性能研究，包块血细胞黏附、凝血时间及血凝块强度，表征了止血材料在体外使血液凝固的能力。凝血血块强度则是表征止血材料止血性能及预防伤口再次出血的重要指标。凝血实验显示，辐照交联后制备的止血材料吸附红细胞及血小板的能力明显提高。这是由于辐照交联的止血材料具有多孔结构及较大的比表面积，在微观上体现为吸附红细胞及血小板的能力增强，宏观上则为凝血时间的缩短。止血材料的强吸附能力导致形成更稳定以及更强的血块。意味着辐照交联后复合大孔聚多糖止血材料具有更好的凝血性能。

综上所述，辐照交联技术制备的复合大孔聚多糖止血材料展现了较好的吸液及凝血性能，在伤口止血方面具有良好的应用前景。

志谢：感谢对本研究提供资助的广东省深圳市科技计划项目（JCYJ20150616163111759），福建省厦门市第五批“双百计划”项目和福建省厦门市科技计划项目（3502Z20151087）。

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（收稿日期：2017-12-08 本文编辑：张瑜杰）