刘 玲　傅 晓　柯皓天　吕 银

(1.四川省丝绸工程技术研究中心，四川成都　610031；2.四川省丝绸科学研究院，四川成都　610031)

SSR(Simple Sequence Repeats)即简单重复序列DNA，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，由Moore 和Sollot terer 于1991 年提出，是以1-6 bp核苷酸为重复单位，多次串联重复组成的DNA序列[1]。SSR具有多态性高、实验操作简单、共显性等优点，目前已应用在桑树的遗传多样性分析、杂交组合亲本多态性及遗传背景等方面。本文就桑树SSR实验过程中的技术要点进行分析。

1　基因组DNA提取

桑树基因组DNA提取一般采用稍加改进的CTAB法[2]从硅胶干燥过的桑叶中提取，但当桑叶中含糖量过高时，这种方法不能将多糖完全除尽。

用4×CTAB法正式提取之前，加如下两个步骤：(1)在桑叶粉中加入1.5mL去糖buffer，震荡混匀，冰浴10min；(2)7000rpm，4℃离心10min；(3)去上清液，加入4×CTAB提取液，进行稍加改进的CTAB法的步骤。实践证明，去糖buffer能去除大量多糖(图1)。

M： Marker；1-7： 直接用4×CTAB法提取的样品；1’-7’：在正式提取前加了两个步骤的样品

去糖buffer配制：1M/L Tris-HCl 100 mL，0.5M/L EDTA 50mL，NaCl 7.305g，加去离子H2O定容至500mL，高压蒸汽灭菌后即可使用。

2　引物筛选

参考桑树SSR分析相关文献，如RAMESH K. AGGARWAL等[3]，Weiguo Zhao等[4]，Mathithumilan Balachandran等[5]，选择其中的100多对引物，根据序列号在Genbank上查看引物信息，确定每对引物目的产物的长度，并下载。下载完毕，在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上比对，选出在川桑基因组中分布均匀的引物，引物合成以后用2-3个性状不同的桑树品种进行筛选。

3　PCR扩增

3.1　PCR反应体系优化

SSR是一种基于PCR技术的分子标记，实验结果易受反应组分的影响。由于研究方法、目的、实验材料、引物、技术要求不同，桑树SSR-PCR反应体系没有固定的标准。为了确保实验结果的准确性和重复性，在正式PCR扩增实验前，可采用单因素设计和正交设计任意一种，或者两种方法结合的方式，对PCR反应体系中的组分进行优化。……