高分辨率熔解曲线技术检测非小细胞肺癌患者胸水中EGFR基因突变

2018-07-12谈云陈姝颖汤俊明乔国洪何超毛旭华

中国肿瘤外科杂志 2018年3期

谈云，　陈姝颖，　汤俊明，　乔国洪，　何超，　毛旭华

肺癌是发病率较高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占80%，大部分患者发现时已处中晚期[1-2]。目前，以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)为代表的分子靶向药物治疗是晚期NSCLC有效且低毒性的治疗方法。而体细胞EGFR基因突变是对EGFR-TKI靶向治疗是否有效的主要依据。高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)是2003年出现的一种基因序列分析技术，具有闭管操作不易污染，检测快速、准确、成本低廉等优点[3]。我们采用HRM法对NSCLC患者胸水中EGFR基因突变进行检测研究，探讨该方法临床应用价值。

1　资料与方法

1.1标本收集

收集2015年1月至2016年11月，江苏大学附属宜兴市人民医院经细胞学检查确诊为NSCLC的30例患者胸水作为研究对象，其中男13例，女17例，年龄38～72岁，中位年龄62岁。

1.2实验方法

1.2.1DNA制备取30 ml胸水，3 000 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀，保存于-80 ℃备用。选用Omega Blood DNA Kit D3392血液DNA提取试剂盒(美国Omega Biotek公司)提取细胞沉淀DNA，并进行DNA纯度及浓度检测。

1.2.2高分辨率熔解曲线法引物设计及反应体系与反应条件HRM法引物设计见表1。HRM法检测仪器采用Roche LightCycler 480 system(瑞士罗氏公司)。总反应体积为20 μl，其中包括Light Cycler HRM Master Reaction Mix(瑞士罗氏公司)， 200 nmol/L引物，3 mmol/L MgCl2和样品DNA模板。HRM法反应条件为：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环(采用touch down技术，前10个循环退火温度从65 ℃降到55 ℃，每个循环降1 ℃)。扩增结束后直接进行HRM分析，反应条件为95 ℃1 min，40 ℃1 min，熔解曲线数据收集从70 ℃到95 ℃，温度上升速率为1 ℃/s，40 ℃冷却[4-5]。