何义亮，陈奕涵

(上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)

【项目团队介绍】何义亮教授长期从事环境工程领域的教学、研究和工程实践，在国内外富有影响的学术刊物以及国际水质协会年会等重要的国际会议上发表论文百余篇，编撰出版学术专著两部。作为课题负责人，主持“十一五”、“十二五”国家科技重大专项《水污染控制与治理》研究课题两项；作为项目负责人，先后承担五项国家自然科学基金项目；作为PI，参与新加坡政府CREATE重大国际合作项目E2S2，并负责环境新生污染物课题研究。团队研究方向主要包括水污染控制与水环境修复、新生污染物环境行为、膜功能开发与应用。

随着经济社会的快速发展和化学品使用的急剧增加，大量新兴污染物与传统污染物一起被排放进入环境，近年来虽然传统污染物无论在实际削减控制中，还是在科学研究中，均取得了一定程度的进步，但是关于环境中新兴污染物的研究尚在起步，很多问题亟待解决，尤其是与人类健康最为密切的水环境[1]。中国作为最大的发展中国家，也是世界上最大的农药和抗生素制造和使用国家，快速的经济发展和滞后的环境保护所涌现出的新兴污染物问题更加严重，尤其是农药和抗生素的不合理使用问题极为突出，已经给我们水环境的保护带来了严峻的挑战。研究表明，我国农药年平均使用量在200万t以上，而60%～70%田间使用的农药会通过农业径流释放到水环境中[2]。同样地，2013年我国约有16.2万t抗生素被使用，其中46%的抗生素通过一系列环境行为排放到水环境[3]。尽管在自然水体中农药或者抗生素的含量并不高，但在水环境中持续性存在，依然会对水质安全和水生生物的健康以及生态系统的稳定性带来破坏，甚至会通过饮用水和食物链影响人体健康[4-5]。

进入现代社会以后，随着人们改造自然的程度加深，数以万计的水坝在河流上游被建造以用于工程水利的需求，人类通过水坝调节水库在防洪、供水和经济社会发展中发挥的功能，但大坝在一定程度上也会破坏河流的原始水文模式和生态系统连接性。目前，世界上大约具有50 000个高型水坝(坝高>15 m)，以大坝为标志的水库累计蓄水容量约在7 000～8 300 km3，综合集水面积约为3.1 × 105km2(不包括天然湖泊)[6]。我国作为世界上建设水库最多的国家，15 m以上高坝水库约占全球的46%，并且拥有世界上最大的水利工程——三峡水库。目前，我国已建成水库85 288座，总库容约为5.6 × 1011m3，为天然湖泊储水量的两倍之多[7]。水库已然成为人类影响地球表面水体的重要水利工程，广泛分布于世界各地。不同于河流系统的是，水库系统水流速度较小，且水体更替较为缓慢，但可以很好地承纳从上游河流输入的水、营养物质、悬浮物、生命体和有毒有害污染物等，并将其转换为库内水动力、地球化学和生物过程。虽然在实际水环境中，“源输入-河流-水库”模式的普遍性已逐渐被大家认识到，但是尚未开展新兴污染物在这种模式下的研究。即使目前国内外已经开展一些关于水环境中农药和抗生素的赋存特征研究，但也仅仅聚焦于单个水环境，诸如单个孤立的河流、水库和湖泊等，并没有全过程地开展新兴污染物在水环境中的研究[8-12]。因此，系统性地开展“源输入-河流-水库”模式下典型新兴污染物的赋存特征及其生态风险水平的研究具有十分重要的现实意义。

1 研究背景

东江源区作为重要的饮用水水源地——东江的源头集水区，非点源污染是源区内主要的污染形式，其中农业面源和分散式畜禽养殖是主要的污染来源。源区内水系主要由河流系统和水库系统组成，其中河流系统主要由一级支流和二级支流组成，具备理想的“源排放-河流-水库”水环境模式。因此，以东江源区为依托，选择典型的农药和抗生素为目标污染物，在时空尺度上对水体中其赋存特征及生态风险水平进行研究，这将有助于更好地理解新兴污染物在水环境中的地化行为和生态风险的变化规律，以期为流域水污染控制和环境保护提供科学依据。

2 材料与方法

2.1 研究区域概况及样本采集

东江源区集水区域横跨江西、广东两省，地理坐标介于东经114°56′～115°55′，北纬24°18′～25°12′，流域面积为5 150 km2，涵盖范围主要包括安远县、定南县，寻乌县和龙川县区域，如图1所示。东江源区内一级支流主要有寻乌水和贝岭水，二级支流主要有马蹄河和下历河，其中寻乌水河长和贝岭水河长分别为138 km和140 km,马蹄河河长和下历河河长分别为36 km和35 km。由北(人类活动区)至南(自然保护区)汇合于广东省最大的干流型水库——枫树坝水库(平均库容为12.5亿m3)，最终缓冲混合后流入东江。基于上述考虑，分别在本研究区域内设置13个采样点(图1)，其中河流系统有S1～S8共8个点，分别为安远县高坝村(S1)、定南九曲村(S2)、定南桃溪村(S3)、定南长滩电站(S4)、寻乌竹子垇(S5)、寻乌长滩峰电站(S6)、寻乌麻疯村(S7)、龙川渡田河(S8)；水库系统有S9～S13共5个点，分别为贝岭水入库(S9)、库1缓冲区(S10)、寻乌水入库(S11)、库2缓冲区(S12)和库尾(S13)。同时，根据现场调研情况，S3和S5两点分别流经定南县城和寻乌县城，且河流沿途两岸农业活动密集，水土流失严重，本研究中归类为人类直接干预较为严重的源输入河流；而S1、S2、S4、S6、S7和S8则归类为自然河流；由于枫树坝水库座落于广东省龙川枫树坝自然保护区，多年的封山护林和水库移民工程，本研究认为枫树坝库区(S9～S10)水环境直接受到周围人为污染的情况较少。

图1 东江水源区及采样点分布图Fig.1 Sampling Sites in the Water Source Region of the Dongjiang River

样品采集工作分别于2015年7月(平水期)、2015年11月(枯水期)和2016年3月(丰水期)进行，其中每个河流取样点采集表层水样，而每个水库取样点采集上、中、下三层水样等份混合形成的混合样本。现场采集水样立即保存于棕色玻璃瓶中，低温运回后处理。

2.2 主要试剂与仪器

本研究共选择31种有机农药和17种抗生素作为目标检测物，其中31种有机农药分别包括有机氯农药(α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH、p,p′-DDD、p,p′-DDE、p,p′-DDT和o,p′-DDT)、有机磷农药(甲胺磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、甲基异柳磷、喹硫磷、杀扑磷、丙溴磷、三挫磷、伏杀硫磷)和拟除虫菊酯农药(联苯菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯)，17种抗生素分别为磺胺类抗生素(磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹喔啉)、喹诺酮类抗生素(诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星)、β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄、青霉素G、青霉素V)、四环素类抗生素(氧四环素、四环素、强力霉素)、大环内脂类抗生素(泰乐菌素、脱水红霉)和其他类(林可霉素、万古霉素)，同时有机农药和抗生素的上机定量内标分别为反式苄氯菊酯-d6和诺氟沙星-d5，上述这些物质的标准品均购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH。甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、甲酸和乙腈等有机溶剂(HPLC级)均购于Thermo Fisher Scientific；盐酸和Na2EDTA(分析纯)购自于国药集团化学试剂有限公司；水样过滤使用0.45 μm滤膜、固相萃取装置和小柱Poly-Sery HLB均购于上海安谱科学仪器有限公司；本试验所用超纯水取自Milli-Q纯水仪。

有机农药测定采用Agilent公司7890B型气相色谱仪串联5977A型质谱仪(GC-MS)，并配有HP-5MS色谱柱(325 ℃,30 m × 0.25 mm×0.25 μm)。抗生素测定采用Thermo Fisher Scientific公司Ultimate3000型液相色谱仪串联三重四级杆TSQ Quantum型质谱仪(LC-MS/MS)，并配有Agilent公司C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)。

2.3 样品预处理

有机农药样品前处理：上样前，HLB小柱依次使用5 mL甲醇，5 mL丙酮∶正己烷(1∶1)，5 mL乙酸乙酯，10 mL蒸馏水各活化3 min；同时每个样品设置三平行(1 L/平行)，使用0.45 μm水相滤膜过滤去除颗粒态，然后将过滤得到的1 L水样接入活化后的HLB小柱，维持3～5 mL/min的流速进行富集，水样富集结束后使用10 mL超纯水冲洗内壁并继续富集，彻底结束后真空泵抽干30 min。再依次使用5 mL乙腈，20 mL丙酮∶正己烷(1∶1)进行洗脱，每次驻留3 min左右，收集液分别采用氮吹仪浓缩至1 mL左右后转至定量浓缩管，并加入3 mL正己烷∶丙酮(1∶1)作为转换溶剂，氮吹至0.3 mL左右加入25 μL上机内标反式苄氯菊酯-d6(2 000 μg/L)使得终浓度为100 μg/L，最后再用正己烷∶丙酮(1∶1)定容至0.5 mL，然后低温保存至-40 ℃待测[13]。

抗生素样品前处理：将三平行过滤后的水样保存在1 L棕色磨口瓶中，分别加入0.5 g Na2EDTA并搅拌至充分溶解，随后用浓盐酸将水样的pH值调节至3左右再进行固相萃取操作。首先分别用10 mL甲醇和10 mL Milli-Q水(pH值= 3.0)进行HLB活化，每次加入各活化3 min，然后接好大容量采样管，水样维持3～5 mL/min的流速进行富集，水样富集结束后使用10 mL Milli-Q (pH值= 3.0)超纯水冲洗内壁并继续富集，随后再向小柱加入5 mL超纯水(5%甲醇)驻留3 min，结束后继续抽真空约30 min。使用10 mL甲醇洗脱小柱，收集液合并后氮吹至近干，最后采用0.5 mL诺氟沙星-d5内标(80 μg/L)溶解定容并低温保存至-40 ℃待测[14]。

2.4 检测分析

有机农药GC-MS检测条件如下。(1)气相色谱条件：进样口温度为280 ℃，不分流进样；载气高纯氦气流速为1.0 mL/min；升温程序：70 ℃保持1 min，25 ℃/min升至145 ℃，10 ℃/min升至310 ℃保持5 min，315 ℃后运行5 min。(2)质谱条件：四级杆温度为150 ℃，离子源温度为230 ℃，传输线温度为300 ℃，离子化能量为70 eV。数据采集方式采用离子扫描模式，溶剂延迟为5 min，目标化合物出峰时间、定量离子以及定性离子如表1所示。采用内标法进行定量分析，且标准曲线相关系数稳定大于0.99(5～800 μg/L)，以枫树坝水库水体进行加标回收试验，在加标浓度为50 ng/L条件下，有机农药回收率为70%～120%；以10信噪比为定量限，定量限为0.14～1.30 ng/L。

表1 有机农药的质谱检测离子和主要参数

抗生素LC-MS/MS检测条件如下。(1)液相色谱条件：将0.1%甲酸溶液(V/V)作为流动相A，乙腈溶液作为流动相B，流动相流动速度为0.3 mL/min。色谱柱柱温设置为30 ℃，进样体积为10 μL。梯度洗脱程序为：95%流动相A(0～2 min)；95%～60%流动相A(2～8 min)；60%流动相A(8～10 min)； 95%流动相A(10～12 min)。(2)质谱条件：电离源为电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，喷雾电压为3 500 V，鞘气压力为30 kPa，辅助气压力为10 kPa，使用氮气作为锥孔气，氩气作为碰撞气，以多反应监测模式(MRM)对目标抗生素的质谱参数进行定性和定量分析，如表2所示。采用内标法进行定量，且标准曲线相关系数大于0.95(5～800 μg/L)，以枫树坝水库水体进行加标回收试验，在加标浓度为50 ng/L条件下，抗生素回收率为69%～121%；以10信噪比为定量限，定量限为0.03～0.75 ng/L。

表2 抗生素的质谱参数

注：*为定量离子

2.5 生态风险评价

2.6 数据分析

数据处理及可视化分别采用SPSS 21及Origin 8.5进行，多元统计分析和热图制作使用RStudio完成,数据分析过程中，若p<0.05则视为具有统计学差异。

表3 基于藻类、无脊椎动物类、鱼类的农药毒性数据 (单位：μg/L)

注：“-”表示未找到,毒理数据均来自ECOSAR

表4 基于藻类、无脊椎动物类、鱼类的抗生素毒性数据 (单位：μg/L)

(续表)

注：“-”表示未找

[未完待续]