黄春湲 王洪 梁浩 叶力 梁冰玉 蒋俊俊 陈荣凤 宁传艺廖艳研 余军 黄颉刚

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）具有很强的复制能力，能引起获得性免疫缺陷综合征，对全球的公共卫生来说是一个巨大的威胁［1］。随着抗逆转录病毒药物治疗的广泛应用，HIV耐药性毒株也随之增多［2］，甚至有些新感染患者携带的HIV病毒已经对目前获批准抗逆转录病毒药物产生耐药性［3-4］。假病毒（pseudovirus）是指一种反转录病毒能够整合另外一种不同种类病毒的囊膜糖蛋白，从而形成具有外源性病毒的囊膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒［5-6］，在耐药检测方面的优点逐渐突显。随着HIV假病毒相关研究的发展，有关我国HIV-1不同亚型的假病毒构建逐渐增多［7］。但目前国内针对HIV-1 B亚型构建假病毒的研究甚少，而关于广西HIV-1 B亚型假病毒的构建尚未见有报道。广西HIV-1 B亚型主要是泰国B亚型，与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的B亚型毒株序列十分接近［8］。王茂鹏等［9］用于制备的HIV-1 B 亚型假病毒的包膜来源于HIV-1 B亚型病毒急性感染人类的血浆，且文中并未说明该假病毒在全国范围的通用性。因此，本实验预期构建针对广西HIV-1 B亚型的假病毒系统。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、细胞 pNL4-3.Luc.R-.E-由广西药用植物园研究所吴无畏教授惠赠；pcDNA TM3.1（+）购自Invitrogen公司；pSV-EGFP质粒、293t细胞、TZM-bl细胞由本室自存；感受态细胞DH5α（TIANGEN）为用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺处理得到的。

1.1.2 主要试剂 High Pure Viral RNA Kit高纯度病毒RNA提取试剂盒购自瑞士Roche公司；Prime-ScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒、PrimeSTAR®MaxDNA Polymerase PCR扩增试剂盒、DNA纯化试剂盒、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司；质粒小量提取试剂盒购自广州欣研生物科技有限公司；GenJet转染试剂购自美国Signagen公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM培养基购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR扩增和env基因片段的鉴定 用Roche High Pure Viral RNA Kit试剂盒从HIV-1 B亚型患者血浆样本中提取病毒RNA。用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒对RNA进行逆转录合成cDNA模板。用巢式PCR的方法扩增HIV-1env基因，引物序列：第一轮上游env1F：5′-TAGAGCCTTGGAAGCATCCAGGAAGTCAG-3′，下游env1R：5′-TAGCCCTTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTA-3′；第二轮上游env2F：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGAGAGTGATGGAGATCAGG-3′，下游env2R：5′-CGGGATCCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGC-3′。为了进一步验证病毒株为B亚型，参照文献［10］，对HIV-1 pol区基因全长进行扩增及测序，对所获得的pol序列采用MEGA 5.03软件构建部分毒株Neighor-joining系统进化树进行分型验证。env区两轮扩增体系为50 μL：25 μL PrimeSTAR®MaxDNA Polymerase（2×）、1.5 μL上游引物、1.5 μL下游引物、5 μL cDNA 模板/第一轮扩增产物，RNase Free ddH2O补足50 μL。两轮扩增条件为：98℃10 s；55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min 30 s，35 cycles；72 ℃ 10 min，4℃保温。琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。

1.2.2 pcDNA3.1-env重组质粒的构建 用HindⅢ、BamHⅠ分别双酶切env基因片段和载体pcDNATM3.1（+），对所得反应液进行DNA纯化并测定浓度后用T4 DNA连接酶进行连接。将重组载体转化至感受态细胞DH5α中，铺板、挑取单个生长的菌落进行培养。收集菌液采用质粒小量提取试剂盒进行pcDNA3.1-env重组质粒的小量提取并用Nano drop 2000测定所得质粒浓度，经双酶切琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.3 pNL4-3.EGFP.E-R-重组骨架质粒的构建自行设计含有NotⅠ、XhoⅠ酶切位点的EGFP基因扩增引物，引物序列上游EGFP-F：5′-GCGGCCGCAATCGATGTACCGCGGGCCCGG-3′，下游 EGFPR：5′-CTCGAGTCTAGAGTCGCGGCCGCTCTTGTACAG-3′。采用PrimeSTAR®MaxDNA Polymerase进行扩增，反应程序为：98℃ 10 s；55℃ 5 s，72℃1 min，35 cycles；72 ℃ 10 min，4 ℃保温。用NotⅠ、XhoⅠ分别双酶切EGFP基因片段和骨架质粒pNL4-3.Luc.E-R-，然后进行DNA纯化、转化及重组质粒的扩增，并采用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，经双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 重组质粒外源性基因的表达验证 （1）将获得的pcDNA3.1-env质粒转染至293t细胞。以24孔板为例：转染前1 d以（2.0～3.0）× 105/孔种板，转染前1 h给细胞换液，把稀释后的pcDNA3.1-env质粒和稀释后的GenJet转染试剂进行混合，室温孵育15～30 min后加入24孔板中，混匀；5～8 h后换液继续培养48 h后弃上清，PBS清洗1次，加入RIPA裂解液反复吹打以收集细胞蛋白，离心取上层液；采用BCA法测定蛋白质浓度，蛋白定量后采用Western blot法检测env基因表达，并使用Odyssey双色红外荧光成像系统对条带进行扫描，获取图像。（2）将获得的重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-转染至293t细胞，转染、培养方法步骤同上，最后采用荧光显微镜观察细胞EGFP表达情况。

1.2.5 假病毒的获得 将重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-与重组包膜质粒pcDNA3.1-env共同转染至293t细胞中：转染前1 d以（2.0～ 3.0）×105/孔种板；转染前1 h给细胞换液，把稀释后的质粒DNA（骨架质粒与包膜质粒质量比为1∶2）和稀释后的GenJet转染试剂进行混合，室温孵育15～30 min后移至24孔板中，混匀；5～8 h后换液继续培养48 h后收集上清，假病毒即存在上清液中；用0.45 μm过滤器过滤后-80℃保存或进行感染实验。

1.2.6 假病毒感染TZM-b1细胞 感染前1天将TZM-b1细胞以（8.0～10.0）×104/孔种于24孔板；感染前换液，每孔加入DMEM完全培养基300 μL，200 μL 假病毒液，5 μL 的 polybrene（1 μg/μL），置于37℃、5%CO2培养；48 h后通过荧光显微镜观察EGFP表达情况。

2 结果

2.1 重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-的鉴定及EGFP基因表达验证 重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-经双酶切电泳验证的结果见图1，所得片段大小符合预期，约为740 bp左右。将获得的重组骨架质粒转染到293t细胞中，48 h后通过荧光显微镜观察重组质粒EGFP表达情况见图2，外源性EGFP基因成功克隆至重组骨架质粒中并能正常表达。

图1 重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-鉴定电泳图Fig.1 The electrophoretogram of recombinant plasmid pNL4-3.EGFP.E-R-

图2 pNL4-3.EGFP.E-R-质粒转染293t细胞荧光表达Fig.2 The fluorescent expression of 293t cells transfected with plasmid pNL4-3.EGFP.E-R-

2.2 重组pcDNA3.1-env质粒的获得及鉴定

2.2.1env全长基因片段的获得 部分样本的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，在指示带3 000 bp附近为扩增阳性样本，即env基因片段。图中显示7份阳性扩增样本，其中，17、20、23号样本条带单一且清晰，可直接用于克隆；8、16号条带较弱，并出现非特异性扩增，需进行凝胶回收后方可进行克隆；2、9号条带很弱，需稀释后重新扩增以增加目的基因量。经HIV-1 pol区序列Genotyping初步分型和系统进化树验证，病毒为HIV-1 B亚型（图4）。

图3 HIV-1 env基因扩增电泳图Fig.3 The electrophoretogram of HIV-1 env gene

图4 广西壮族自治区不同亚型HIV-1感染者基因序列的系统进化树分析图Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the gene sequences of HIV-1 infected individuals from different subtypes in Guangxi Zhuang Autonomous Region

2.2.2 重组pcDNA3.1-env质粒的获得及鉴定 获得重组pcDNA3.1-env质粒，经双酶切、凝胶电泳鉴定阳性克隆。结果如图5所示，以8号样本为例，图中5.5 kb左右条带为载体pcDNA3.1条带，3 kb左右条带为克隆到载体中的env全长基因，共获得4个阳性克隆，8-5为假阳性克隆。

图5 pcDNA3.1-env重组质粒鉴定电泳图Fig.5 The electrophoretogram of recombinant plasmid pcDNA3.1-env

2.2.3env蛋白的鉴定 通过Western blot验证重组载体中env基因表达的正确性。如图6所示，前4个泳道为阳性克隆转染组，均表达gp160蛋白，即env蛋白；5号泳道为骨架质粒单转染组（阴性对照），未见env蛋白表达。从HIV-1感染者血浆样本中提取的病毒RNA，通过扩增并经电泳鉴定共获得8份阳性扩增产物。分别将扩增产物克隆到pcDNATM3.1（+）中，每个样本挑取5～10个克隆进行双酶切验证，共获得10个阳性克隆。

图6 Western blot检测env基因重组质粒表达包膜蛋白Fig.6 Western blot detection of env gene expression from recombinant plasmids

2.3 携带EGFP基因的重组HIV-1假病毒具有单轮感染性活力 将克隆阳性的重组质粒pcDNA3.1-env与重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-共同转染到293t细胞，重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-单转染293t细胞作为对照，经48 h后收集细胞上清液。将收集的上清进行感染实验，即把上清与TZM-b1共培养48 h后用荧光显微镜检测荧光表达情况。结果如图7所示，共转染组上清与TZM-bl细胞共培养后可以观察到荧光，骨架质粒单转染组上清与TZM-bl细胞共培养后无荧光表达。同时，收集感染TZM-b1细胞48 h后上清并加入到新的TZM-b1细胞中进行第二轮感染，共培养48 h后用荧光显微镜观察细胞中荧光表达，结果如图8所示未见有荧光表达，表明获得的重组假病毒只具有单轮感染性。

图7 重组假病毒感染TZM-b1细胞48 h后荧光表达情况Fig.7 The fluorescent expression of TZM-b1 cells infected with recombinant pseudovirus at 48 h post-infection

图8 TZM-b1细胞上清液第二轮感染TZM-b148h后荧光表达情况Fig.8 The fluorescent expression of TZM-b1 cells with second round infection by supernatant in TZM-b1 cell culture of first round infection at 48 h post-infection

3 讨论

据文献报道，广西HIV-1患者耐药发生率高于全国水平，不同亚型HIV-1流行株的耐药发生率不同［11］，且鉴于耐药性毒株对广西艾滋病防控和治疗的种种危害，提高对HIV-1耐药性变化的关注尤为重要。目前，检测HIV-1耐药的方法主要是基因型耐药性检测及表型耐药性检测。基因型耐药检测仅能作为间接证据来评估样本的耐药性，在出现复杂组合耐药位点时，其对耐药性的判定未能考虑到耐药位点间相互作用的效应［12］。表型耐药检测则能很好地克服基因型检测的这些缺点，可以直接得出直观的耐药性数据，是目前检测耐药的金标准。但传统的实验方法耗时耗力，在分离病毒的过程中忽视了选择效应的作用。而基于重组病毒技术的假病毒法表型检测大大缩短了检测时间，简化了操作步骤，可以避免活病毒检测法培养病毒时发生的基因突变，并且这种技术还可以和基因型耐药检测结果结合起来分析［13］。

针对不同亚型的毒株构建表型耐药检测假病毒有助于HIV-1患者的耐药检测。目前已有大量研究［7，9］针对我国HIV-1不同亚型毒株假病毒进行构建，而此前并没有关于广西HIV-1 B亚型假病毒构建的报道。广西地区目前流行的HIV-1毒株有CRF01_AE、CRF08_BC、CRF07_BC、B亚型，B亚型占据了一定的比例［11，14］，较四川、贵州等地［15-16］的比例不同；而B亚型是欧美流行的优势毒株，在20世纪80年代传入我国云南静脉吸毒人群，随着时间的推移发生变异，并在我国广泛流行开来。从地理位置来看，广西流行的B亚型毒株，与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的B亚型毒株间存在密切关系，流行时间短于云南而稍长于内地其他省［8］。鉴于广西B亚型与我国其他地区B亚型有差异，本研究将HIV-1骨架载体pNL4-3.Luc.E-R-改造为携带EGFP基因的重组骨架质粒，并与自行构建的表达HIV-1 B亚型env基因的表达性pcDNA3.1-env重组质粒共转染至293t细胞中成功获得了具有单轮感染活性的假病毒。但是，这套系统对于表型耐药检测的实际应用尚需进一步验证。

综上，本研究成功构建了一种以EGFP为报告基团的广西HIV-1 B亚型假病毒系统，具有单轮感染活性。可采用此系统进行人群队列耐药性监测，并同时结合基因型耐药检测的方法，综合分析解释广西HIV-1 B亚型感染者耐药性的演变，为制定更加科学合理的预防耐药发生的干预措施提供理论依据，也为构建多种HIV-1基因亚型假病毒提供了参考。

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