益气通脉解毒方对急性心肌梗死大鼠心肌梗死面积及VEGF和bFGF蛋白表达的影响*

2018-06-26徐春梅

中国中医急症 2018年6期

陈宁徐春梅

（1.山东省青岛市即墨区中医医院，山东青岛 266200；2.山东省青岛市即墨区人民医院，山东青岛 266200）

心肌梗死为多发性心血管病，急性心肌梗死是由于冠状动脉粥样硬化斑块破裂，激活血小板和凝血，形成血栓完全阻塞冠状动脉所致，是严重危害人们健康的疾病［1-2］。血管内皮细胞生长因子（VEGF）可形成新的血管，增加血管的通透性，是目前最广泛治疗性血管新生的因子之一［3-4］。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可促进成纤维细胞、对血管内皮细胞生长、对内皮细胞内蛋白酶的分泌，促进血管平滑肌细胞及神经细胞的生长［5］。在心肌缺血缺氧的条件下，在周围的受损心肌细胞中均有VEGF和bFGF的表达增高。中医学认为瘀血阻络、气虚血瘀是导致急性心肌梗死的主要原因，治宜活血化瘀［6］。益气通脉解毒方为青岛市即墨区中医医院治疗急性心肌梗死的院内协定处方，具有活血益气、化瘀解毒功效，具有较好的临床疗效，但其作用机制尚不明确。因此，本研究旨在观察益气通脉解毒方对急性心肌梗死大鼠心肌梗死面积及VEGF和bFGF蛋白表达的影响并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只健康雄性清洁级Wistar大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2011-0011。雌雄各半，体质量（250±20）g。自然光线，分笼饲养，以标准饲料和无菌蒸馏水喂养。

1.2 试药与仪器益气通脉解毒方：黄芪20 g，丹参15 g，川芎 20 g，赤芍 10 g，红花 10 g，延胡索 10 g，莪术 10 g，三棱 10 g，黄连 10 g，葛根 10 g，甘草 10 g。药材均为本院中药房提供，取处方药材，加8倍量水煎煮2次，滤过，并制成生药含量1 g/mL的煎煮液。水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），HE染色液（Sigma公司），VEGF和bFGF单克隆抗体试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。倍他乐克片（阿斯利康制药有限公司，规格：25 mg/片。批号：20170216）。注射用青霉素钠（江西东风药业股份有限公司，规格：80万单位。批号：20170309）

1.3 模型制备 30只大鼠适应性饲养1周后开始实验。水合氯醛麻醉大鼠后，固定于手术台，碘酒消毒，在左胸第4与第5肋骨间作横切口，打开胸腔，使心脏充分暴露于外，剪开心包，无创缝线结扎冠状动脉左前降支，心肌稍微变白、心脏搏动稍减弱，心电图出现ST段上抬，抬高到弓背向上为造模成功。然后上少许青霉素面剂，逐层缝合皮肤，清除术野，关闭切口。腹腔注射青霉素 3 d，200 万/（kg·d），预防感染［7］。

1.4 分组与给药将成模大鼠随机分为中药组、西药组与模型组，每组10只。中药组给予益气通脉解毒方灌胃，5 mL/kg，每日1次。西药组给予倍他乐克灌胃，剂量为4.5 mg/kg，每日1次。模型组给予0.9%氯化钠注射液灌胃，5 mL/kg，每日1次。连续灌胃4周。

1.5 标本采集与检测 1）测定左室收缩内径、左室舒张內径、左室射血分数和左室短轴缩短率。灌胃4周后，麻醉后脱毛膏与备皮刀将左胸部残余毛发清除，进行也脏功能测定，取左心室分别测定左室收缩内径、左室舒张內径、左室射血分数和左室短轴缩短率。2）观察梗死面积。检测完心功能后，剪开胸腔，迅速取出心脏，生理盐水清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。固定后的心脏左心室心肌沿短轴横切成2 mm厚薄片，置入含0.5%NBT pH7.4的磷酸盐缓冲液，37℃恒温水浴染色15 min，观察梗死面积。3）免疫组化法检测VEGF和bFGF蛋白表达。取组织切片，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，切片常规脱蜡、水化，按免疫组化试剂盒提供的实验步骤进行操作。图象分析系统观察结果，随机测定5个视野，计算每100倍视野中平均灰度值，取其均值为该切片灰度值，代表该组织内VEGF和bFGF蛋白含量。

1.6 统计学处理应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用 t检验，计数资料以 n（%）表示，应用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较见表1。4周后，中药组的左室短轴缩短率和左室射血分数高于对照组，左室舒张内径和左室收缩内径低于对照组（P＜0.05），但与西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

与模型组比较，△P＜0.05。下同。

2.2 各组大鼠病理组织比较见图1。模型组大鼠心肌细胞坏死，细胞核溶解、消失，纤维结缔组织增生，炎症细胞浸润，中药组和西药组也肌细胞坏死减少，纤维组织增生较少，少量炎症细胞浸润。西药组与中药组比较无明显变化。

2.3 各组大鼠心肌梗死面积比较见表2。中药组与西药组心肌梗死面积均显著低于模型组（P＜0.05），但中药组与西药组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠心肌组织病理改变比较（HE染色，100倍）

表2 各组大鼠VEGF和bFGF蛋白表达及心肌梗死面积比较（μm2，±s）

2.4 各组VEGF和bFGF蛋白表达比较见表2，图2～3。中药组和西药组的VEGF和bFGF蛋白水平高于模型组（P＜0.05），但中药组与西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠VEGF蛋白表达情况比较（HE染色，400倍）

图3 各组大鼠bFGF蛋白表达情况比较（HE染色，400倍）

3 讨论

急性心肌梗死是冠状动脉粥样硬化斑块破裂，激活血小板和凝血过程，形成血栓完全阻塞冠状动脉所致，发病率逐年増加且发病年轻化的趋势，严本危害人民健康［8］。研究证实心肌凋亡心肌坏死和心肌重构中起着重要作用，新生血管可促进生长因子生长，与血管生成过程中多种生长因子、蛋白酶、趋化因子等有关［9］。VEGF为血管平滑肌细胞因子，可刺激内皮细胞增殖，促进微血管通透性增加，其分泌的血管内皮细胞黏附因子进一步促进炎性细胞与冠状动脉内皮细胞的黏附，引起CRP、TNF-α炎症因子释放，损害患者的心肌功能［10-11］。bFGF可促进新生血管形成，促进修复组织损伤，急性心肌梗死患者心肌缺血缺氧，血管平滑肌和心肌受损，引起bFGF水平降低［12］。中医学认为急性心肌梗死是气虚血瘀所致，通畅气血可有效改善患者的病情。益气通脉解毒为本院心内科治疗急性心肌梗死的协定处方，方中黄芪补气固表、丹参丹参为君药，川芎、赤芍、红花化瘀止血为臣药，莪术、三棱性皆微温，为化瘀血之药，加强臣药功效，黄连清热通便，散风止痛，葛根生津止喝，共为佐药，甘草调和诸药为使药，全方具有活血益气、化瘀解毒功效。因此，本研究旨在探讨益气通脉解毒方对急性心肌梗死大鼠心肌梗死面积及VEGF和bFGF蛋白表达的影响。

本研究发现，4周后中药组的左室短轴缩短率和左室射血分数高于模型组，左室舒张内径和左室收缩内径低于模型组，说明益气通脉解毒方可改善急性心肌梗死大鼠局部病理改变。这与益气通脉解毒方中的黄芪强心苷改善心室肌收缩和舒张，有效逆转损伤心室肌密切相关［13］。中药组和西药组也肌细胞坏死减少，纤维组织增生较少，少量炎症细胞浸润，减少心肌梗死面积。益气通脉解毒方中丹参可抑制心肌成纤维细胞分裂，川芎、红花均活血化瘀，提高细胞内超氧化物歧化酶的生物活性，改善局部血液循环，抑制平滑肌细胞及成纤维细胞增生有关［14］。中药组和西药组的VEGF和bFGF蛋白水平高于模型组，说明益气通脉解毒方可提高急性心肌梗死大鼠VEGF和bFGF蛋白表达，保护损伤的心肌。川芎能促进心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生，减少左心室重构，改善心功能，莪术、三棱减少血管内血栓形成，抑制血管内动脉粥样硬化进程，保护缺血心肌，黄连、葛根扩张冠状动脉、减轻微血管阻力，益气通脉解毒方提高心肌抗缺血能力，修复损伤心肌细胞，提高VEGF和bFGF蛋白表达［15］。

综上所述，益气通脉解毒方可改善急性心肌梗死大鼠局部病理改变及减少纤维化，减少梗死面积，提高VEGF和bFGF蛋白表达，发挥保护心肌性损伤作用。

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