徐依雯，张运海，杨皓旻，刘 创，唐玉国

(1.中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所，江苏省医用光学重点实验室，江苏 苏州 215163；2.中国科学院大学，北京 100049)

1 引 言

双光子显微镜是非线性光学显微镜中应用最广泛的一种[1]，在双光子荧光显微镜成像时，荧光分子必须同时吸收两个长波长光子才能达到激发态，然后发射出一个波长较短的光子，实现成像[2]，因此双光子成像对激发光的光子密度要求很高，只有焦点及其附近非常小体积内的荧光分子能够被激发，这种激发特性使得双光子具有极高的三维分辨率[3-4]。由于双光子采用近红外波段的激发光，波长较长，穿透性好，在某些生物样本如血管中成像深度甚至能超过1 mm[5]，对细胞的光毒性也小，非常适合用来观察活细胞甚至活组织[6]。双光子显微镜因其低光毒性、大成像深度和高三维分辨率的优势成为生物医学及药学领域重要的研究工具[7-8]，被广泛用于神经、血管以及肿瘤等相关方面的研究[9-11]。

在双光子显微成像中，虽然长波长光的光毒性较弱，光漂白也局限于焦点处，但是由于高数值孔径物镜和窄激光脉宽等原因，聚焦光斑处光功率密度极高，焦平面的荧光分子仍然会发生严重的荧光漂白[12]。Alexander Hopt等人的研究表明，激光造成的光损伤与激光脉冲宽度成反比，即激光脉宽越窄，对荧光分子的光损伤越大[13]。双光子成像为了保证激光光子密度，通常采用飞秒激光器作为光源，脉宽几百飞秒的短脉冲激光会带来非常严重的荧光漂白，影响了双光子长时间成像所取得的荧光图像质量，研究降低双光子成像时荧光漂白的技术显得十分重要。……