赵宝顶 宋平 张怡 刘敬为 乔璐 童应凯

摘 要：本文通过对布拉酵母分别在YEPD培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、混合培养基（YEPD+肉汤）中与3种菌（大肠杆菌，藤黄八叠球菌，枯草芽孢杆菌）的混合培养，通过稀释涂布、抑菌圈与液体发酵的方式来测定布拉酵母对于3种菌的抑菌性，结果显示，布拉酵母在不同培养基中队3种菌的抑菌效果不同，而抑菌圈实验没有出现抑菌圈，布拉酵母对不同菌的抑菌效果和生存环境有关。

关键词：布拉酵母；抑菌性；混合培养基

中图分类号：S816. 7 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180233007

酵母菌也是在饲料中應用最早、最广泛的微生物之一[1]。伴随着生物的高速发展，酵母菌的研究与开发利用也在不断深化，新发现的布拉酵母菌有促进肠道有益微生物的活性、抑制病原菌和促进肠黏膜免疫功能等作用[2]，布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）是益生菌的一种，它属于酿酒酵母，布拉酵母菌具有促进肠道内有益微生物的活性、中和肠道病原菌产生毒素的毒性、促进肠黏膜的免疫功能与降解病原菌毒素及肠黏膜毒素受体等作用，布拉酵母还拥有生物学优势，它可以耐高温，在37℃环境中仍然生长良好，在耐酸性环境细胞存活率仍能达到75%[3]。

现在食品安全的问题受到人们重视，造成人们肠道疾病的的发病率越来越高[4]，抗生素的弊端越来越引起人们的重视，抗生素对于一些特异性体质的人会产生过敏反应，严重时会导致死亡[5]。而布拉酵母菌作为一种益生菌，能构建起抵抗病原体的第一道防线[6]。布拉氏酵母作为一种非病源酵母对抗生素相关的腹泻和复发性艰难梭菌结肠炎具有保护作用，其机制与增强宿主肠道免疫应答有关[7]。布拉氏酵母菌还能够促进肠道内短链脂肪酸的活性，可以迅速地恢复肠道的正常生理功能[8]，另外，在酵母细胞还能够作为饲料添加物，它含有丰富的氨基酸以及多种的维生素，这是动物生长所必需的营养物质[9]。

大肠杆菌是人体与动物肠道内最常见的一种菌类，大约占到肠道内菌类的1%，大肠杆菌离开肠道后，会引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等，一些体质偏弱的人极易感染，大肠杆菌还会进入血液，从而引起败血症[10]。枯草芽孢杆菌自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可以与体内的其他酶共同作用，促进一些细胞的活性[11]。藤黄八叠球菌是一种条件致病菌，在特殊情况下才会对人体造成危害。

综上所述，布拉酵母的研究性非常高，而且布拉酵母的体外抑菌效果尚很少有人研究，本实验针对布拉酵母的抑菌性展开初步研究，通过布拉酵母与3种细菌的混合培养来了解布拉酵母的抑菌性，并且用抑菌圈实验来研究布拉酵母抑菌的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

布拉酵母（Saccharomyces boulardii），大肠杆菌（Escherichia Coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），藤黄八叠球菌（sarcina lutea）均为天津农学院生物技术系微生物实验室保存菌种。

1.1.2 培养基

YEPD（酵母浸出粉胨葡萄糖）培养基（%）：酵母膏 1、蛋白胨2、葡萄糖2，在115℃高压灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨培养基（%）：牛肉膏0.5、蛋白胨1.0、氯化钠0.5，pH7.2～7.4 121℃灭菌20min。

混合（YEPD：肉汤=1：1）培养基：121℃灭菌 20min。

1.2 种子液制备

在超净工作台中将布拉酵母菌用250mL三角瓶接入YEPD培养基中，放入30℃ 摇床中以180rpm培养18～24h，放入4℃冰箱中保存备用。

在超净工作台中将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌用250mL三角瓶接入肉汤培养基中，放入37℃摇床180rpm培养18～24h，放入4℃冰箱中保存备用。

1.3 菌种混合培养试验

设置对照组，18个瓶子里每个瓶中分别添加5mL的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及藤黄八叠球菌，然后在每种培养基中取不同菌种各1瓶添加5mL的布拉酵母菌。

其余2个培养基的菌种添加同表1，添加后放至35℃摇床中，以200转/min放置，养24h后涂布计数，并进行显微镜观察。

1.4 抑菌圈试验

1.4.1 培养基制备

配制600mL的肉汤培养基，高压灭菌后在超净工作台中分于3个250mL三角瓶中，每个瓶中加200mL，待温度于40～50℃时，加入3种细菌，每个三角瓶中加入4mL，每种培养基倒4个平板，共12个平板，等待凝固。

1.4.2 布拉酵母菌悬液处理

取布拉酵母菌悬液离心，清液和沉淀布拉酵母菌体，用生理盐水多次冲洗离心沉淀布拉酵母菌体，得到布拉酵母菌体，取一部分布拉酵母菌体进行超声波处理，破碎细胞，得到布拉酵母胞内产物。

1.4.3 抑菌圈试验

将凝固好的平板在超净工作台中打孔，平板中加入的因素如下表。

其余2种平板同上表2，添加后放入37℃恒温箱中培养24h。

2 结果与分析

2.1 菌种混合培养试验结果分析

由表3可知，在YEPD培养基中的单种大肠杆菌生长情况比较好，加入布拉酵母后大肠杆菌数量减少；单种枯草芽孢杆菌在10-6中生长情况良好，加入布拉酵母后数量明显减少；单种藤黄八叠球菌生长情况都不好，加入布拉后数量有一定的增长。

由表4可知，在牛肉膏蛋白胨培养基中的单种大肠杆菌生长情况非常好，加入布拉酵母后数量有一定的减少；而枯草芽孢杆菌和藤黄的生长都没有收到明显影响。

由表5可知，在混合培养基中的单种大肠杆菌生长情况良好，加入布拉酵母后受到明显影响，数量明显减少；枯草芽孢杆菌生长没有影响，而藤黄八叠球菌在加入布拉酵母后受到明显影响，数量减少。

由此可见，在YEPD培养基中布拉酵母菌对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有一定的抑制效果；在牛肉膏蛋白胨培养基中布拉酵母对枯草芽孢杆菌和藤黄八叠球菌没有影响，而对大肠杆菌有轻微的抑制效果；在混合培养基中对大肠杆菌和藤黄八叠球菌都有明显的抑制效果，因此，布拉酵母菌在特定的环境下对3种细菌有抑菌性，也可以促进一些细菌的生长，也可能是通过吸附病原菌的作用，将细菌吸附在周围。

2.2 抑菌圈试验结果分析

枯草芽孢杆菌平板的抑菌圈如图1。

大肠杆菌平板的抑菌圈如图2。

藤黄八叠球菌平板的抑菌圈如图3。

由上图观察，并未发现抑菌圈，可以推测，布拉酵母自身或者代谢产物对细菌都没有直接的抑制效果。

3 结论

混合培养试验结果显示，布拉酵母在一定环境下有抑制某些菌的生长，但抑菌圈试验表明布拉酵母对细菌的抑制并不是直接的，其抑菌机理仍待进一步研究。

参考文献

[1]李晓颖.布拉酵母的研究现状[R].2013：3-25.

[2] Canani RB，Cucchiara S，Cuomo R，et al.Saccharomyces boulardii：a summary of the evidence for gastroenterology clinical practice in adults and children[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15（7）：809-822.

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[11]郭小华，陆文清，邓萍，等.益生枯草芽孢杆菌MA139增殖培养基的优化[J].中国农业大学学报，2006，11（3）：41-46.

作者简介：童应凯，教授，天津农学院农学与资源环境学院生物技术系。