陈 玲，张 兵，宋亚芬，刘月焕，蒋桃珍*

(1.中国兽医药品监察所，北京100081; 2.北京市农林科学院，北京100097)

禽腺病毒属(Aviadenovirus)原称为I群禽腺病毒(Group I avian adenovirus)，主要宿主为鸡、火鸡和鹅。病毒分类学第九次报告[1]将禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)分为A、B、C、D、E 5个种，12个血清型，火鸡腺病毒(TAdV)和鹅腺病毒(GOAdV)各划分为一个种。以前的研究表明，腺病毒在鸡体内普遍存在，但常呈隐形感染，很少出现临床症状，当与其它致病病原混合感染时才导致一些临床症状。最早报道的禽腺病毒感染是1949年发现的鹌鹑支气管炎，1957年确认的鸡胚至死孤儿病毒[2]。但近年来，FAdV已成为鸡的一种重要的致病病原之一，如FAdV-1(A)感染后，可以引起肌胃糜烂；FAdV-4(C)是心包积液综合症(hydropericardium syndrome, HS)的主要病原，该病于1987年首先在巴基斯坦卡拉奇附近的安卡拉村发现，因此也称为“安卡拉”病[3-4]；D和E种的某些毒株可以造成严重的肝脏损伤，导致包涵体肝炎(inclusion body hepatitis, IBH)[4]。

自2013年起，国内鸡群出现由FAdV引起的心包积液、包涵体肝炎症状的病例开始增多，到2015年，国内多个省份的许多养禽场流行FAdV感染，感染鸡群出现以心包积液、肝脏肿大等病理变化为主的高死亡率的临床疾病，给国内养鸡业带来了严重的经济损失[5-6]。试验通过对一株FAdV田间分离毒株的Hexon L1基因进行序列分析、在LMH细胞适应后的生物学特性分析及不同代次毒液对SPF鸡的致病性变化研究，为进一步开展FAdV流行毒株分子流行病调查研究及弱毒疫苗毒株的培育与筛选提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 病料、标准4型禽腺病毒、4型禽腺病毒阳性血清和LMH细胞 北京平谷养鸡场疑似FAdV感染的鸡肝组织，由北京市农林科学院刘月焕研究员提供；标准4型禽腺病毒(AV211)、4型禽腺病毒阳性血清和LMH细胞由中国兽医药品监察所制备和保存。

1.2 SPF鸡 3周龄SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物有限公司。

1.3 主要试剂 大肠杆菌JM109感受态细胞、RNA提取试剂盒、DNA Marker为Takara产品； Reverse Transcription System为Invitrogen公司产品；pfu高保真聚合酶为Promega公司产品；pGEM-T载体购于Promega公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Omega产品；DMEM/F12(1∶1), Foetal Bovine Serum为GIBCO产品。

1.4 病毒培养和传代 将肝脏组织剪成小块后置于研钵中，倒入适量液氮，充分研磨，按1∶5的体积比加入含双抗(1000 U/mL)的PBS(1/15M pH7.2)，-80 ℃反复冻融三次，8000 r/min离心10 min，取上清，经0.22 μm滤膜过滤除菌，接种已长成单层的LMH细胞，37 ℃培养3 d，收获后接种新的LMH细胞，并在LMH上连续传至第15代(C1-C15)。

1.5 病毒鉴定

1.5.1 PCR鉴定 参照文献[7]，用PCR方法扩增Hexon L1序列。

表1 Hexon L1引物Tab 1 Hexon L1 primers

参照Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0说明书，提取4型标准毒株和C3、C7、C11、C15代病毒基因组，以Hexon A/Hexon B为引物进行PCR扩增。反应体系：2×Ex Taq Mix 25 μL，HexonA/HexonB(10 uM/L)各2 μL，模板5 uL。ddH2O 16 μL；反应条件：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增结果。

将PCR产物回收后，与pGEM-T载体连接，转化到JM109细胞，取100 μL涂布含有氨苄的LB琼脂，37 ℃过夜培养。利用菌落PCR的方法鉴定重组子，挑选阳性克隆送往上海立菲生物技术有限公司测序。

1.5.2 中和试验-特异性鉴定 用含DMEM/F12培养液将C5代毒稀释至200TCID50/0.1mL，取1 mL与等量的4型禽腺病毒阳性血清混合，同时设病毒对照，37 ℃作用1 h，病毒中和组和对照组各接种5孔LMH细胞，每孔接种0.2 mL。同时设LMH细胞对照5孔，每孔加入0.2 mL含1%胎牛血清的DMEM/F12培养液。将48孔板置37 ℃，5%CO2条件下培养5～7 d，观察细胞病变。

1.6 病毒在LMH上的生长特性研究 测定C1-C15各代病毒的滴度，以传代次数为横坐标，logTCID50/0.1mL为纵坐标，绘制病毒在LMH上的生长曲线。

将C10稀释10000倍，取1 mL接种已长满单层的LMH细胞，37 ℃吸附1 h后，补充9 mL维持液。分别在接种培养的12、24、36、48、60、72、84、96、108和120 h取出细胞瓶，反复冻融三次，收获病毒。取病毒悬液按Reed-Meunch方法计算不同收毒时间的TCID50，并绘制C10在LMH上的生长曲线。

1.7 致病性试验 将30只3周龄SPF鸡随机分为3组，每组10只。第一组鸡腿部肌肉接种 0.1 mLC5代毒，其病毒含量为106.5TCID50/0.1mL；第二组鸡接种0.1 mL C15代毒，病毒含量为107.4TCID50/0.1mL；第三组为阴性对照，注射等量的生理盐水。每天观察和记录试验鸡的发病和死亡情况。

2 结 果

2.1 LMH细胞培养结果 肝脏组织病料在LMH上盲传3代后，在LMH产生明显的细胞病变，其特征为细胞变大变圆，聚集成不规则的葡萄串状，聚团外的细胞间隙明显增大，与4型腺病毒标准毒株(AV211)出现同样特征的细胞病变(图1)。

A 正常的LMH细胞；B禽腺病毒标准毒 (AV211); C分离毒株.A normal LMH; B FAdV standard strain(AV211); C isolated strain图1 标准毒株(AV211)和分离毒株在接种LMH细胞后48 h细胞病变情况(10X)Fig1 CPE on LMH caused by standard strain(AV211) and isolated strain 48 h post-inoculation(10X)

2.2 PCR鉴定 4型标准毒株和C3、C7、C11、C15代病毒均可以扩增出大小约为900 bp的Hexon L1片段(图2)。与ATCC FAdV 12个血清型标准毒株的Hexon L1片段进行比对后，绘制核苷酸进化树(图3)。可以看出分离毒株扩增出的保守序列大小与4型禽腺病毒标准毒株完全一致，且与4型FAdV处于同一分支。

M: DL1000，分子量大小从上到下依次为1000、700、500、400、300、200 bp；1-6依次为4型标准毒株、C15、C11、C7、C3和阴性对照M:DL1000, Molecular weight from top to bottom are 1000,700,500,400,300,200 bp; 1-6:serotype 4 standard strain,C15,C11,C7,C3 and negative control图2 标准毒株和各代次病毒Hexon L1片段电泳图Fig 2 Hexon L1 electrophoresis chart of standard strain and different generations of isolated strain

图3 各代次分离毒株与4型标准毒株、FAdV 12个血清型标准毒株的Hexon L1核甘酸序列进化树Fig 3 Hexon L1 nucleic acid sequence evolution tree of different generations of isolated strain, serotype 4 standard strain and 12 serotype standard strains of FAdV

2.3 中和试验结果 分离毒株与4型禽腺病毒标准阳性血清中和后接种LMH细胞，不产生细胞病变，而病毒对照组都出现细胞病变，说明分离株能被4型禽腺病毒阳性血清完全中和。

表1 中和试验结果Tab 1 The result of serum neutralization test

2.4 致病性试验结果 C5和C15细胞毒接种SPF鸡后，均在第2 d开始出现死亡，且鸡只死亡时间集中在2～4 d。死亡鸡剖检，可见心包腔中有淡黄色清亮的积液；心包有斑点状出血；肝脏肿大、出血(图4)。C5和C15引起的死亡率分别为100%和70%，C15组未死亡鸡精神沉郁、羽毛蓬松，10 d后恢复正常。说明分离毒株经细胞适应后，仍可导致3周龄SPF鸡100%，且C5可导致SPF鸡100%死亡。

表2 C5和C15毒液对SPF鸡的致病性试验结果Tab 2 The pathogenic result of C5 and C15 on SPF chickens

A心包腔有淡黄色清亮液体；B心包斑点状出血；C肝脏脂肪黄染，肿大A amber colored liquid in the pericardial sac; B mottling hemorrhage on pericardium; C swelling liver with yellow color图4 死亡鸡心脏和肝脏大体病变Fig 4 Heart and liver lesion of dead chicken

2.5 病毒在LMH上的培养结果 随着病毒在LMH上的传代增加，其对细胞的适应性逐渐增加，病毒滴度呈现上升趋势，至第8代，病毒培养滴度趋于稳定，8～15代培养物的病毒含量均在107.2～107.4TCID50/0.1mL，详见图5。

病毒在LMH上的滴度在感染后72 h达到峰值107.4TCID50/0.1mL，随后略微下降，详见图6。

图5 不同代次病毒在LMH上的增殖滴度Fig 5 The virus titer of different passages on LMH

图6 不同培养时间病毒在LMH上的增殖滴度Fig 6 The virus titer on LMH at different point of time

3 讨论与小结

鸡感染禽腺病毒出现心包积液综合症的病例首次报道于1987年，该病发生在巴基斯坦的安卡拉地区。上世纪90年代，在伊拉克、印度、墨西哥、厄瓜多尔、秘鲁、智利、美国和俄罗斯等国家都相继报道有该病的发生和流行[8]。牛登云等[9]在2014～2016年期间，对我国鸡群中禽腺病毒感染情况进行了调查，发现我国大部分地区鸡群普遍存在禽腺病毒感染，且引起鸡群的发病和死亡，发病和死亡鸡的主要剖检变化表现为包涵体肝炎和心包积液综合征。从高发病地区的血清型调查结果来看，包涵体肝炎主要以FAdV8a/b(E)感染为主，而引起心包积液综合症的主要是FAdV-4型(C)。临床上心包积液的病例大多数存在着与鸡传染性贫血病毒(CAV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)等病原混合感染的情况[10]，这也是禽腺病毒感染后导致高发病率和死亡率的一个重要因素。但是，在研究的致病性试验中，采用纯净的FAdV-4型分离株接种SPF鸡，C5代毒仍能导致其100%发病和死亡，表明禽腺病毒田间分离株可以直接导致感染鸡发病和死亡，其近期分离毒株的毒力已明显高于早期分离毒株。

FAdV一般采用鸡胚肾细胞(CEK)和鸡胚肝细胞(CEL)两种原代细胞进行分离和培养[11]，但原代细胞制备繁琐、易污染，不利于实验操作；LMH作为一种肝癌细胞系，可以无限传代，用于FAdV培养时，可以产生明显的细胞病变且病毒滴度高[12]。因此，研究直接采用LMH细胞对疑似禽腺病毒感染发病鸡的临床病料进行病毒分离培养，获得了一株FAdV毒株。通过血清学试验、基因序列分析等鉴定结果，表明分离到的病毒为4型禽腺病毒。此外，该4型禽腺病毒细胞适应毒的培育，为进一步开展禽腺病毒的研究工作奠定了基础。

细胞或组织连续传代培养一直是传统弱毒疫苗研发的主要技术之一。例如，鸡传染性支气管炎弱毒疫苗W93株就是由其亲本强毒毒株在鸡胚上连续传代致弱获得的[13]；日本乙型脑炎弱毒疫苗株SA 14-14-2是强毒株SA14在原代地鼠肾(PHK)细胞连续传代的产物[14]；通过鸡胚成纤维细胞(CEF)和BHK-21连续传代的方式可以获得鸭坦布苏病毒的弱毒株[15]。试验中将分离的FAdV在LMH上连续传15代后，其C15代毒对SPF鸡的毒力明显低于C5。C5代毒以每只鸡106.5TCID50接种后可导致接种鸡100%死亡 而C15代毒以高于C5代毒约10倍剂量(107.4TCID50/每只)接种SPF鸡后，引起的死亡率则为70%。该结果表明FAdV经LMH细胞连续传代后，可明显降低病毒毒力。因此，可以推测，将分离到4型禽腺病毒在LMH细胞经过连续传代致弱，有可能获得一株弱毒疫苗候选株，为今后进一步开展弱毒疫苗的研发提供了研究基础。

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