何秋阳，钟国梁，杨国顺，张灿清，马顺高

(大理白族自治州人民医院检验科，云南 大理671000)

浆膜腔积液是一种重要的病情标志，可分为漏出性、炎性及恶性三大类，临床上浆膜腔积液的性质关乎病情的治疗策略[1]。目前，利用显微镜检查浆膜腔积液的脱落细胞是确诊其性质重要手段，但该方法易受取材、检验者个人经验等因素影响，导致其检出率低。因此如何提高恶性浆膜腔积液的检出率已成为当前亟待解决的问题。恶性肿瘤细胞DNA结构和含量的异常是其基本生物学特征之一，基于该特征，使得利用流式细胞术的DNA倍体分析技术检测浆膜腔脱落细胞中的DNA含量成为明确其性质的又一重要途径[2]。尽管DNA倍体分析在细胞鉴定领域的应用逐渐普及，但其对浆膜腔积液性质的诊断尚需进一步证实。本研究应用用流式细胞仪 (flowcytometer，FCM)和Meta分析系统对经临床确诊的95例良性及68例恶性浆膜腔积液样本进行DNA倍体分析，同时结合传统光学显微镜检查，探讨DNA倍体分析技术在良恶性浆膜腔积液诊断中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年 4月－2015年2月本院收治的浆膜腔积液患者163例，男94例，女69例，年龄 20～88 岁，平均年龄(55.7±15.8)岁。 全部病例均经临床最终确诊，良性浆膜腔积液95例，恶性浆膜腔积液68例。所有检查均采用同一次抽取的胸水标。

1.2 仪器与试剂 采用美国BECKMAN COULTER公司的XL/MCL流式细胞仪及该公司生产的分析试剂。

1.3 方法

1.3.1 FCM检测 取积液50ml离心后去上清液，加10ml PBS液洗涤2次后再调节细胞数至5×106/L，采用贝克曼公司提供的试剂破膜、溶血，加入PIN荧光染色剂与细胞结合15min。以正常人外周血淋巴细胞为对照。测定DI值。

1.3.2 细胞学检测 胸水经离心沉淀后制片用刘氏染液染色，传统光学显微镜下观察脱落细胞形态。阳性为检出异形细胞（疑为癌细胞）、检出恶性细胞和检出癌细胞；阴性为未检出恶性细胞。

1.4 FCM 检测 良、恶性判断标准[3，4]：⑴正常二倍体细胞 DI值为 0.9～1.1，其余均为异倍体。 ⑵出现DNA的非整倍体(即发现异倍体)为恶性。⑶无明显的非整倍体峰，但有一突出的四倍体峰和大于15%的S期细胞，并伴有G0/GI期CV值大于9%为恶性。⑷无明显的非整倍体，但G0/GI期CV值增大，并伴有大于10～15%的S期和一个突出的四倍体峰，为可疑恶性。（见图1和图2）

图1 DNA倍体分析（正常二倍体）

图2 DNA倍体分析（异倍体）

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件包，对检测结果进行卡方检验。

2 结果

本研究共收集163例浆膜腔积液样本，其中恶性积液样本68例，良性积液样本95例。DNA倍体分析方法对恶性积液样本检测的灵敏度及特异性分别为75%、97.9%，阴性预测值及阳性预测值分别为 84.5%、96.2%；浆膜腔积液脱落细胞镜检对恶性积液样本的灵敏度及特异性分别为42.6%、100%，阴性预测值及阳性预测值分别为70.9%、100%；而两种方法的联合灵敏度为95.6%，联合特异性为1（见表1）。上述结果经卡方检验表明，DNA倍体分析的灵敏度及阴性预测值均显著高于传统的脱落细胞镜检（P＜0.01），且两种方法的联合灵敏度均高于单一检测方法（P＜0.05），但两种方法的特异性及阳性预测值无差异，且与联合特异性也无显著差异。

3 讨论

传统的显微镜检查浆膜腔积液脱落细胞是鉴别良、恶性的金标准，但恶性肿瘤细胞检出率低，同时有些细胞介于良恶性之间，很难做出诊断[5]。细胞学检查能诊断出1/2～2/3的恶性浆膜腔积液[6]。但在恶性浆膜腔积液早期，仅有少量细胞为恶性时诊断较困难。DNA倍体是指一个个体细胞所含染色体组的数目，单倍体细胞是仅含一个染色体组的细胞，二倍体细胞是含二个染色体组的细胞，如果某个体细胞的染色体比二倍体多或少一条染色体，都称为异倍体。由于测定细胞核DNA含量比计数核中染色体的数目容易，简单方便，故倍体通常理解为细胞核DNA的含量，而相应的细胞称为二倍体，多倍体和异倍体[7，8]。人体正常的体细胞均有较恒定的DNA二倍体含量，而在细胞癌变过程中将伴随细胞DNA含量的异常改变，当细胞内DNA含量异常时，用FCM检测可检出DNA异倍体[9，10]。流式细胞术是20世纪70年代逐渐发展起来的一门新的细胞分析技术，集计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学和细胞免疫学等多门技术为一体。近二十年来，通过流式细胞技术分析DNA逐渐成为鉴别浆膜腔积液良恶性的辅助方法[11，12]。本研究也显示，流式细胞术进行浆膜腔积液DNA倍体分析敏感性67．6%，明显高于传统光学显微镜检查39．7%，特异性93．7%，略低于显微镜检查97．9%，和贾留群[13]等报道敏感度74%，特异度高0．94%基本相符，采用浆膜腔积液脱落细胞DNA倍体分析来判断积液的良恶性存在一定的假阴性和假阳性[14]，本文检测结果表明，其假阴性和假阳性分别为32．4%和6．3%，造成假阴性的主要原因是肿瘤细胞未脱落至浆膜腔；DNA异倍体检测需要相当数量的DNA异常细胞，较小的染色体异常可能不能被流式细胞仪检测到；非整倍体峰太小被整倍体峰掩盖；某些肿瘤细胞DNA的丢失和复制平衡，导致肿瘤细胞净DNA正常[15]；另外也与高分化的二倍体肿瘤有关；假阳性可能是与浆膜腔积液中存在大量的炎性细胞和多核细胞等有关。运用浆膜腔积液脱落细胞DNA倍体分析来判断积液性质，可以提高阳性检出率，适合于脱落细胞的良恶性质判断筛查，两种联合有助于提高恶性浆膜腔积液诊断的敏感性和特异性，且可进行早期癌前诊断，对于了解肿瘤细胞的增殖情况及恶性程度和预后也有重要的临床意义。

表1 DNA倍体分析及镜检方法对163例浆膜腔积液脱落细胞的检测及统计结果

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