査文勇 陆晓燕 赵双双

（上海上药第一生化药业有限公司，上海200240）

0 引言

维生素B12，又称为钴胺素，是唯一含有金属元素的维生素。自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等植物和动物不能制造维生素B12。同时，维生素B12是唯一一种需要肠道分泌物（内源性因子）帮助才能被吸收的维生素。有些人由于肠胃异常，缺乏这种内源性因子，即使有足够的食物来源，他们仍会患上恶性贫血。在目前已知的植物性食品中基本上都不含有维生素B12，且其停留在肠道的时间很长，大约需要3h（大部分水溶性维生素只需几秒钟）才能被吸收。

维生素B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，预防恶性贫血以及脑损伤。维生素B12是浅红色针状结晶，易溶于水和乙醇，但是不溶于丙酮、乙醚或氯仿。其在pH值为4.5～5.0的弱酸条件下最稳定，在强酸（pH=2）或碱性溶液中会分解，遇热会少量受损，但短时间的高温消毒损失小，遇强光或紫外线易被破坏，普通蒸煮过程的损失量约为30%。

本文主要考察影响注射用水溶性维生素中B12含量的因素，通过比较两种不同的配制方法，择优选取其中一种，使得产品的合格率得到显著提升。

1 实验材料和设备

1.1 实验材料

1.1.1 处方组成

注射用水溶性维生素的处方组成如表1所示。

1.1.2 试剂

磷酸二氢钾（批号20170109），国药集团化学试剂有限公司；乙腈（批号17070452），TEDIA公司；10%盐酸溶液（批号170922）、磷酸二氢钾（批号T20100804），国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钾（批号F20100813），国药集团化学试剂有限公司；磷酸（批号20170109），国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 对照品

烟酰胺（含量99.9%），批号100115-201604；硝酸硫胺（含量99.8%），批号100297-201402；盐酸吡哆辛（含量100.0%），批号100116-201404；泛酸钠（含量99.9%），批号100279-201203；维生素C钠（含量99.9%），批号100296-201104；维生素B12（含量90.2%），批号100248-201203。

1.2 仪器和设备

不锈钢钢桶、搅拌棒、不锈钢钢勺、玻璃棒、烧杯、不锈钢杯子、剪刀、不锈钢棒；Agilent1200型高效液相色谱仪，安捷伦公司；ME104型天平、AB135-S型天平，梅特勒公司。

表1 处方组成

2 方法和结果

2.1 配制方法和测定方法

2.1.1 配制方法

2.1.1.1 方法1配制过程

（1）准确称取配制总量80%的注射用水（水温控制在65～70℃）置于160L不锈钢桶中，通氮气（有气体冒出即可）5min后，分别取其中的1L注射用水置于两只塑料勺中（水温控制在60～65℃），将配制量的维生素B12（注意避光）加入至塑料勺中，用玻璃棒不断搅拌5min后沉淀约5min，视其全部溶解，将配制量的生物素加入至另一塑料勺中，用玻璃棒搅拌使其全部溶解，混合后即得溶液1。

（2）将配制量的甘氨酸、尼泊金甲酯、依地酸二钠、核黄素磷酸钠（注意避光）、烟酰胺、叶酸、硝酸硫胺、盐酸吡哆辛、右旋泛酸钠，按顺序逐一投入至上述160L的不锈钢桶中，每投一种原辅料后均需充分搅拌均匀，使其全部溶解，然后再投入下一个原辅料，溶液搅拌均匀后，即得溶液2。

（3）仔细观察溶液1药液澄清后，将其并入溶液2中，并用不锈钢棒搅拌均匀后得到溶液3。

（4）准确称取配制总量20%的注射用水（水温控制在30～40℃）置于40L不锈钢桶中，通氮气（有气体冒出即可）5min，将配制量的维生素C钠投入其中，并用不锈钢棒搅拌均匀，使其溶解，然后并入溶液3（水温控制在30～40℃）中，通氮气（有气体冒出即可）5min，并搅拌均匀。

（5）QA人员取样后，送给质量检验员进行中间体（药液）的分析，测pH值。

2.1.1.2 方法2配制过程

（1）准确称取配制总量80%的注射用水（水温控制在60～70℃）置于配液罐中，通氮气（有气体冒出即可）5min后，取其中的1L注射用水置于玻璃烧杯中，将处方量的生物素加入至玻璃烧杯中，用玻璃棒搅拌使其全部溶解，即得溶液1。

（2）在配液罐中加入处方量的甘氨酸，搅拌使其完全溶解，再依次加入处方量的对羟基苯甲酸甲酯、依地酸二钠、核黄素磷酸钠（注意避光）、烟酰胺、叶酸、硝酸硫胺、盐酸吡哆辛、泛酸钠，按顺序逐一投入至上述配液罐中，每投一种原辅料后均需充分搅拌均匀，使其全部溶解，然后再投入下一个原辅料，溶液搅拌均匀后，即得溶液2。

（3）仔细观察溶液1药液澄清后，将其并入溶液2中，搅拌并降温至20～30℃。

（4）准确称取配制总量20%的注射用水（水温控制在20～30℃）置于不锈钢桶中，通氮气（有气体冒出即可）5min后，取其中的1L注射用水置于玻璃烧杯中，将处方量的维生素B12（注意避光）加入至玻璃烧杯中，用玻璃棒搅拌使其全部溶解，并继续搅拌10min，即得溶液3。

（5）将处方量的维生素C钠投入至上述不锈钢桶中，并搅拌均匀，使其溶解，然后将该溶液并入配液罐。

（6）仔细观察溶液3药液澄清后，将其并入配液罐中，并用不锈钢棒搅拌均匀后，通氮气（有气体冒出即可）5min，搅拌均匀（约10min），测定其pH值应在5.8～6.1。

2.1.2 维生素B12测定

2.1.2.1 色谱条件

维生素B12测定方法的色谱条件如表2所示，梯度比例如表3所示。

2.1.2.2 溶液配制

（1）对照品溶液：取维生素B12对照品约25mg，精密称定，置于250mL量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL，置于100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。（2）供试品溶液：取本品5瓶，用适量水溶解后转移至同一25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制两份供试品溶液。

2.1.3 测定法

2.1.3.1 空白试验

取冷却至常温的注射水，至少进样1针，确认其对测试无干扰。

2.1.3.2 系统适用性试验

取对照品溶液，连续进样5针，记录色谱图，计算维生素B12峰面积平均值及RSD值，RSD值应不大于2.0%。理论塔板数以维生素B12峰计算，应不低于2000，维生素B12与未知峰之间的分离度应该大于1.0。

表2 色谱条件

表3 梯度比例

2.1.3.3 供试品溶液的测定

取供试品溶液，每份溶液进样1针，记录色谱图。

2.1.4 计算与结果判断

以外标法计算：

式中——连续5针对照品溶液主峰平均峰面积；

Ax——供试品溶液主峰峰面积；

Cr——对照品溶液的浓度，mg/mL；

mr——标准品称样量，mg。

每瓶注射用水溶性维生素中含维生素B12应为4.5～6.0μg。

2.2 实验结果

注射用水溶性维生素的两种配制方法中，维生素B12的含量测定结果如表4所示。

2.3 液相图谱

对每批样品都做了两遍平行实验，从液相图谱（由于篇幅有限，本文不再赘述）中可以看出，得出的结果是一致的，说明测定结果是可靠的。

3 结语

从以上分析结果可以看出，配制方法1明显优于方法2，说明维生素C钠可能影响维生素B12的稳定性。此外，在方法1中主要控制了维生素C钠溶液的温度以及维生素C钠溶液加入维生素B12混合前的温度，这样可以极大地避免维生素C钠对维生素B12造成损害，说明方法1的配制工艺科学、合理、有效，既能生产出合格稳定的产品，又能降低生产风险，帮助企业提高经济效益。

表4 注射用水溶性维生素的两种配制方法结果

从表4可以看出：用方法1配制出来的注射用水溶性维生素中的B12含量基本上能够达到5.0μg以上；而用方法2配制出来的注射用水溶性维生素中的B12含量基本上都未能够达到5.0μg。由此说明，配制方法1明显优于方法2。