李善华，周 利，张 霞，李 莉

(1.十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院,湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北 十堰 442000)

脑卒中后抑郁(Post-stroke depression，PSD)属继发性抑郁症，是脑卒中后恢复期最常见的神经系统并发症，因其神经功能恢复延缓，患者常有情绪低落、兴趣减退及睡眠障碍等临床表现，且严重PSD者有自杀行为(或)倾向，因此，研究如何治疗PSD具有重要意义[1]。研究表明，穴位注射鼠神经生长因子(Mouse nerve growth factor，mNGF)可起到营养神经、促进受损中枢神经元生长分化、恢复损伤神经功能的作用[2-3]。此外，大量临床治疗表明，在治疗PSD时，运用通督调神针法针刺神庭、水沟、大椎、百会等穴位可显著改善PSD患者神经功能[4]。目前两者在治疗PSD时相互作用的机制还不太明确，本实验采用膜片钳技术记录海马CA1区自发性动作电位(Action potential，AP)和群峰电位(Population spike，PS)及与学习和记忆相关的神经递质、相关蛋白，并结合行为测试来分析穴位注射mNGF联合通督调神针法对PSD模型大鼠学习和记忆的影响，分析其治疗PSD的机制，力图在此类研究中有所突破，为临床治疗PSD提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选经旷场实验(OPEN-FIELD)行为学评分筛选合格的健康雄性SD大鼠50只，体质量160～170 g，购自湖北医药学院动物中心，所有动物均于实验前适应性饲养1 周。

1.1.2 实验仪器和试剂 WMT-100型Morris水迷宫(成都泰盟)；鼠神经生长因子[舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：017S20060023]；水合氯醛(武汉博菜特化工有限公司)；玻璃电极拉制仪(日本Narishige公司，型号：PP-83)；振动切片机(英国Campden公司，型号：752M)；膜片钳放大器(英国Campden公司，型号：Mul-ticlamp700A)；S100B蛋白和神经丝蛋白(NFP)ELISA试剂盒(上海仁捷生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备和分组 大鼠PSD模型制备[5]：采用OPEN-FIELD筛选合格的健康雄性SD大鼠50只，将评分接近的40只造模。用10%水合氯醛(35 mg·kg-1)腹腔注射，待麻醉后俯卧位固定，剪去颈部皮肤,消毒，铺无菌巾，切开颈部皮肤，分离左侧颈内动脉，结扎左侧颈内动脉(结扎时可在动脉平行放一6号半针头，拉紧丝线，然后抽出针头，这样可使颈内动脉内径缩小1/2)造成大鼠局灶性脑缺血。术后2 h以大鼠行走向对侧倒体或行走转圈、静止时向对侧前肢蜷曲、Zea Longa神经行为学评分为1～4分为纳入标准，0和5分弃去[6]。纳入的动物在术后1周内每天给予1次中等强度的慢性不可预见的温和性应激刺激(Chronic unpredicta-ble mild stress，CUMS),共处理3周。CUMS刺激方法：每天选择以下7种刺激中的一种(或按顺序选择其中的一种)，包括禁食24 h、禁水24 h、夹尾1 min、45℃烤箱烘烤5 min、利用灯光使动物活动昼夜颠倒、4℃冰水游泳5 min、振荡机高速水平振荡30 min等7种刺激方法。以上应激刺激交替进行，刺激后将造模大鼠单独饲养(孤养)。3周后再经过OPEN-FIELD行为学评分筛选成模大鼠进行分组和治疗[7]。

分组：将以上应激孤养3周的造模大鼠再经过OPEN-FIELD行为学评分筛选，保留其中合格(成模)的PSD大鼠20只，随机分为模型组(PSD组)和治疗组,各10只，另10只正常SD大鼠作为正常组。正常组不造模，并且5只共养，不做CUMS处理。

1.2.2 治疗方法 正常组和PSD组不做任何治疗。治疗组针刺取穴参照《实验针灸学》，针刺取“神庭、水沟、大椎、百会”穴位[8]。针刺每日1次，每次25 min，运用“通督调神针法”，中间行针3次，针刺治疗每周 6次为1个疗程，治疗 4 个疗程。针刺后于以上诸穴注射mNGF，注射前参照动物用药计算公式准确计算用药剂量。将mNGF用注射用生理盐水配制成0.1%溶液，按1 mg·kg-1穴位注射，间隔1天注射治疗1次，共注射14天。

1.2.3 Zea Longa神经行为学评分方法 分6个等级，其中无功能障碍记0分；不能伸展前肢记1分；向一侧旋转记2分；向一侧倾倒记3分；无自主活动伴意识抑制记4 分；死亡记5 分。

1.2.4 CA1区脑薄片的制备和膜片钳技术 先配制人工脑脊液并通95%O2+5%CO2饱和，置于4℃冰箱备用。断头处死大鼠，咬去顶骨，迅速分离脑组织，放入4℃饱和人工脑脊液中修整分离出海马CA1区组织，用振动切片机切片(厚约300～400 μm)。孵育1 h后进行膜片钳技术记录海马CA1区自发性动作电位(Action potential，AP)和群峰电位(Population spike，PS)[9]。

1.2.5 免疫组化检测 取CA1区海马脑薄片，石蜡包埋，切片、烤干、脱蜡，用3%HO溶液冲洗10 s，滴一抗，4℃过夜，阴性对照滴加PBS溶液。隔日后室温下复温，滴二抗工作液，37℃孵育10 min，辣根酶标记10 min；用DAB显色，苏木素复染，然后分化、返蓝、脱水、封片。脑薄片SP染色后乙酰胆碱(Ach)和神经丝蛋白(NFP)蛋白阳性为胞浆棕黄色或黄褐色。用图像分析软件统计各组平均光密度值(IOD)。在处死动物前取断尾取0.2 mL尾静脉血，采用免疫吸附法检测静脉血清乙酰胆碱脂酶(AChE)和S100B 蛋白含量[10]。

1.2.6 Morris水迷宫实验 于治疗结束后用WMT-100型Morris水迷宫分析系统中定位航行试验和空间探索实验以确定逃避潜伏期和60 s内穿越原平台次数，结合Zea Langa神经行为学评分评定大鼠学习和记忆能力。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠海马CA1区AP和PS膜电位电位值比较

正常组大鼠海马CA1区AP膜电位电位值和PS记录的膜电位均保持在正常范围(61.32±4.69)mV。PSD组大鼠海马CA1区AP和PS记录的膜电位异常增高，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组AP和PS记录的膜电位明显低于PSD组(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠海马CA1区AP和PS膜电位电位值比较

注：与正常组比较，1)P<0.05;与PSD组比较，2)P<0.05

2.2 大鼠海马CA1区组织中Ach和NFP比较

PSD组大鼠CA1区组织中Ach和NFP含量降低，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组则明显增多，与PSD组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠海马CA1区组织中Ach和NFP比较

注：与正常组比较，1)P<0.05;与PSD组比较，2)P<0.05

2.3 大鼠静脉血清AChE和S100B蛋白含量比较

PSD组大鼠血清AChE和S100B蛋白含量均增高，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组大鼠血清AChE和S100B蛋白含量均降低，与PSD组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 大鼠静脉血清AChE和S100B 蛋白含量比较

注：与正常组比较，1)P<0.05;与PSD组比较，2)P<0.05

2.4 大鼠Morris水迷宫测试结果及Zea Longa神经行为学评分比较

PSD组大鼠定位航行试验逃避潜伏期明显升高，在空间探索试验撤去平台60 s中，PSD组跨越平台次数减少，且大鼠Zea Longa神经行为学评分增大，与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短，跨越平台次数明显增多，且大鼠Zea Longa神经行为学评分较PSD组明显降低，与PSD组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 大鼠Morris水迷宫测试结果及Zea Longa神经行为学评分比较

注：与正常组比较，1)P<0.05;与PSD组比较，2)P<0.05

3 讨论

“PSD”属中医学郁证的“因病致郁”范畴，患者在脑神失常后又会出现五脏神紊乱现象，故其病位虽在脑，但随病性加重而致心、肝、脾、肺、肾等五脏功能异常[11]。鼠神经生长因子(mNGF)是从小鼠颌下腺中提取的一类具有营养神经功能的蛋白，在动物实验中发现其可促进神经功能恢复，改善己二酮或丙烯胺致小鼠中毒性周围神经炎引起的运动障碍[12]。而针刺能起到安神定志、调理气血、醒脑开窍的治疗作用[13]。本实验通过穴位直接注射mNGF，结合通督调神针法针刺神庭、水沟、大椎、百会穴，观察其对PSD模型大鼠学习记忆能力及行为学的影响。

观察发现，治疗组大鼠在干预性治疗后，膜片钳记录显示治疗组AP和PS电位值明显降低，免疫组化发现CA1区组织中Ach表达上调，静脉血AChE降低，这可能是针刺产生的治疗作用。有研究表明，针刺可纠正病灶产生的异常电活动，因PSD模型脑组织存在持续性缺血，这会导致持续Na通道开放，Na+内流增加，这样细胞内Na+浓度持续增加引起神经细胞损伤，这也是PSD组大鼠海马CA1区AP和PS记录的膜电位异常增高的离子基础。而针刺治疗能促进持续开放的Na通道关闭，使Na+内流减少，细胞内外离子水平重新恢复平衡，防止细胞内钙超载，使神经细胞功能得以逐渐恢复[14]。Ach是中枢释放的神经递质,其与大脑的学习、记忆功能密切相关，Ach对于维持意识的清醒及学习记忆起重要作用，而AchE可水解神经突触Ach，降低中枢神经突触Ach含量，造成学习和记忆力下降[15]。本实验中治疗组CA1区组织中Ach表达上调，静脉血AChE降低，提示针刺可提高中枢胆碱能神经释放神经递质Ach，并抑制AChE释放，使神经突触Ach水解减少，这样，中枢神经突触Ach增多，胆碱能神经兴奋性恢复，使PSD导致的学习记忆障碍得以改善。S100B蛋白主要分布于中枢神经系统中的室管膜细胞、星形胶质细胞和树突胶质细胞，大量临床检测发现，PSD患者血清S100B蛋白浓度明显提高，S100B蛋白增高可导致脑组织对缺血缺氧的敏感性，增加神经元损伤及衰亡的风险，而抗抑郁治疗后则显著下降，说明其浓度变化与病情严重程度呈正相关[16]。NFP主要分布于神经细胞胞体和神经突触内，由神经元胞体合成，主要发挥维持神经元功能及轴浆运输作用，可促进受损神经元的修复和再生以尽快恢复神经功能的作用[17]。治疗组CA1区组织中NFP的表达上调，静脉血S100B蛋白含量降低。提示穴位注射mNGF可促进神经细胞胞体和神经突触内NFP的合成，修复受损神经元，同时抑制S100B蛋白合成，降低脑组织对缺血缺氧的敏感性，在一定程度降低神经元持续损伤的风险。治疗组在以上综合作用下，Morris水迷宫实验显示治疗组定位航行实验逃避潜伏期缩短，空间探索实验跨越平台次数明显增多，Zea Langa评分提高，说明穴位注射mNGF联合通督调神针法可改善PSD模型大鼠脑组织及神经系统所处的微环境，消除学习记忆障碍。

总之，在本实验中，穴位注射mNGF可促进NFP的合成，修复受损神经元，同时抑制S100B蛋白合成，降低PSD后脑组织对缺血缺氧的敏感性，起到直接修复和保护受损神经元作用。而采用通督调神针法针刺神庭、水沟、大椎、百会等穴，一方面起到安神定志、醒脑开窍的作用，还可通过提高胆碱能神经突触释放Ach，抑制异常升高的膜电位，减轻神经功能损伤和退化，进而改善PSD大鼠学习和认知功能。

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