李 双，马珊珊，崔思颖，屈素真，蔡奥捷，关方霞*，孔祥东*

(1.郑州大学第一附属医院 遗传与产前诊断中心， 河南 郑州 450052； 2.郑州大学 生命科学学院， 河南 郑州 450001)

杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD,OMIM#310200)是最常见的神经肌肉系统遗传病，为X-连锁隐性，由DMD基因突变引起抗肌萎缩蛋白(dystrophin)合成障碍， 造成肌肉收缩不良[1]， 患

者常于20岁左右死于呼衰或心衰，临床尚无有效治疗方法。

DMD基因含79个外显子，统计显示约80%的DMD患者可通过跳跃特定外显子修复阅读框，恢复部分dystrophin表达[2]，其中可跳跃51外显子(exon51)者约13%[3]。基因编辑可从根本上修复突变基因，并通过细胞分裂稳定传递。成簇规律间隔短回文重复序列系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, associated RNA guided endonuclease Cas9, CRISPR/Cas9) 通过sgRNA(singe-guide RNA)5′端识别DNA，可实现对任意DNA序列的靶向修饰[4- 5]。若同时转入多个sgRNA，则可完成对多个靶向位点或大片段基因编辑[6- 7]。本研究使用人胚肾上皮(HEK293T)细胞，转入靶向DMD基因exon51两端的CRISPR/Cas9单载体质粒系统，实现对指定外显子的敲除并提高了敲除效率，为DMD的基因治疗及机制研究奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293T细胞为实验室所有；PX458/PX459质粒(Addgene质粒库)；限制性内切酶BbsⅠ、XbaⅠ和磷酸化酶FastAP (Fermentas公司)；连接酶Quick ligase(NEB公司)；细胞转染试剂盒ViaFectTMTransfection Reagent (Promega公司)；无内毒素质粒小提试剂盒和细胞基因组提取试剂盒(北京天根生物有限公司)；DMEM高糖培养基和磷酸盐缓冲液(Thermo公司)；胎牛血清(Gemini公司)；T载体(TaKaRa公司)；Detecase内切酶(上海吉凯基因公司)；高保真KOD FX DNA扩增酶(Toyobo公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶位点选择及引物设计：运用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-MLPA)对HEK293T细胞DMD基因进行检测，确认是否完整。

选取DMD基因exon51两端内含子区域序列，应用网站http://crispr. mit.edu/设计靶向sgRNA，每端选取3条分数较高者用于质粒构建。……