范文强，姬宇宙，刘先本

1焦作市第二人民医院心胸外科，河南 焦作454001

2河南省肿瘤医院胸部肿瘤一区，郑州450008

肺癌是恶性肿瘤相关死亡的主要危险因素，是全球主要的公共卫生负担之一，仅在中国，每年肺癌相关的发病和病死患者分别约为70万例和60万例[1-2]。目前，大多数肺癌患者就诊时已处于晚期阶段，5年生存率仅为15%，而早期肺癌患者的5年生存率为30%～40%，因此，早期诊断和有效治疗可明显延长肺癌患者的生存期[2]。在功能上，Wnt蛋白可参与肿瘤的发生和胚胎的发育，包括细胞命运和细胞结构[3-4]。低密度脂蛋白受体相关蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6）是LRP超家族成员之一，Wnt的共受体在Wnt信号转导过程中发挥着主要的作用[5-6]。LRP6蛋白可与Frizzled家族成员结合，导致Wnt信号通路被激活，进而导致β-catenin的稳定性和核易位增强，而LRP6的异常表达可影响Wnt配体与LRP和Frizzled家族成员结合，进而影响受体活化以及肿瘤的进展、恶化[2]。采用抑制剂阻断Wnt配体与LRP6中的Wnt结构域结合，可导致Wnt信号通路及其下游基因被抑制[7]。有研究发现，在小鸡和斑马鱼中，Wnt1的异常表达可通过Lmx1b、Pax2和En2途径调控FGF8的表达[8-9]，而FGF8可促进结直肠癌细胞的增殖，提高细胞的克隆形成能力，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[10]。因此，在本研究中，猜测LRP6作为一种癌蛋白，其可能通过调节FGF8信号促进肺癌细胞的增殖。为了进一步揭示LRP6在肺癌发生、发展中的分子机制，首先利用Western blot法检测了其在肺癌细胞系中的表达；然后，通过在细胞中沉默LRP6表达检测其对细胞增殖和克隆形成能力的影响；最后，研究其是否通过FGF8信号来发挥癌基因的作用。本研究将阐明LRP6在肺癌发生、发展中的作用机制，为临床将LRP6与FGF8作为诊断、治疗肺癌的靶标奠定研究基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞

正常肺细胞CCD-19Lu和肺癌细胞A549、H1299、SPCA-1、L78、PCL3、H460均购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂与仪器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、MEM培养基、RPMⅠ-1640培养基均购自美国Hyclone公司；siRNA（small interfering RNA，siRNA）-LRP6和siRNA-control由上海GenePharma公司合成；Lipofectamine 2000转染试剂、Trizol试剂均购自美国Ⅰnvitrogen公司；PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒均购自大连Takara公司；7300实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）系统购自美国Applied Biosystems公司；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）购自美国Sigma公司；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RⅠPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；抗 LRP6（ab118490）、FGF8（ab89550）、β-actin（ab8245）均购自美国Abcam公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 正常肺细胞CCD-19Lu采用含10%FBS的MEM培养基培养，肺癌细胞A549、H1299、SPCA-1、L78、PCL3、H460采用含10%FBS的RPMⅠ-1640培养基培养。所有细胞均在含5%CO2的细胞培养箱中于37℃下培养。

1.3.2 细胞转染 通过检测发现，LRP6在肺癌细胞A549中的相对表达量最高，因此后续研究将A549作为研究对象。将siRNA-LRP6和siRNA-control按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染至A549细胞中，分别记为siRNA-LRP6组和siRNA-control组。siRNA-LRP6序列：5'-CCG CAT GGT GAT TGA TGA A-3'；siRNA-control序列：5'-UUC UCC GAA CGU GUC CGG A-3'。

1.3.3 qRT-PCR检测 采用Trizol试剂从培养的细胞中提取总RNA，并根据说明书使用Prime-Script RT试剂盒进行逆转录。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒在7300实时荧光定量PCR分析系统上进行qRT-PCR。LRP6 PCR扩增引物：上游5'-GAG CTG GAC TGT TAT CCA ACT G-3'和下游5'-CTT CAT ACG AGG ACA CAG CAT C-3'；β-actin引物：上游5'-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3'和下游5'-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3'。实验至少重复3次。以LRP6/β-actin计算LRP6的相对表达量。

1.3.4 细胞增殖能力检测 MTT实验和克隆形成实验按照先前研究报道的方案进行[11]。将siRNA-LRP6或siRNA-control转染至A549细胞中，于24、48、72 h时分别加入MTT进行测定，在波长490 nm处采用酶标仪测定各组光密度（optical density，OD）值。克隆形成测定按照以下步骤进行：转染48 h后，取500个A549细胞接种于6孔板中，培养10～14 d后，采用结晶紫染色，计数斑点。实验至少重复3次。

1.3.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测 按照先前报道所述的方法进行Western blot检测[13]，收集细胞，RⅠPA裂解液裂解，离心取上清，BCA法测定蛋白含量，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白并转膜，将膜与抗体（LRP6、FGF8、β-actin）进行室温孵育2 h，最后曝光显影。实验至少重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对-数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LRP 6在肺癌细胞系中的表达情况

LRP6在肺癌细胞L78、A549、H1299、SPCA-1、PCL3和H460中的表达水平均明显高于LRP6在正常肺细胞CCD-19Lu中的表达水平，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 LRP 6蛋白在肺癌细胞系中的相对表达量（±s）

表1 LRP 6蛋白在肺癌细胞系中的相对表达量（±s）

细胞CCD-19Lu L78 A549 H1299 SPCA-1 PCL3 H460 LRP6蛋白相对表达量0.22±0.04 0.87±0.07 1.21±0.06 1.02±0.09 1.19±0.09 0.57±0.03 0.78±0.08

2.2 siRNA沉默LRP 6表达

转染siRNA-LRP6后，A549细胞中LRP6mRNA和LRP6蛋白的相对表达量分别为（0.22±0.04）和（0.14±0.01），均明显低于siRNA-control组的（0.94±0.07）和（0.39±0.03），差异均有统计学意义（t=15.468、13.693，P＜0.01）。（图1）

2.3 沉默LRP 6对细胞增殖的影响

转染siRNA-LRP6后，细胞在 24、48、72 h的OD值均低于siRNA-control组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 沉默LRP 6后不同时间点 A549细胞OD值的比较（ n= 3，±s）

表2 沉默LRP 6后不同时间点 A549细胞OD值的比较（ n= 3，±s）

组别siRNA-control组siRNA-LRP6组t值P值24 h 0.58±0.04 0.41±0.03 7.141 0.002 48 h 1.08±0.16 0.78±0.09 2.831 0.047 72 h 1.63±0.21 0.93±0.11 5.114 0.007

2.4 沉默LRP 6对细胞克隆形成能力的影响

结晶紫染色后发现，siRNA-LRP6组细胞的克隆形成数目为（56±13）个，低于siRNA-control组的（119±24）个，差异有统计学意义（t=3.998，P=0.016）。

2.5 沉默LRP 6对FGF 8信号的影响

Western blot法检测结果显示，siRNA-LRP6组A549细胞中FGF8及增殖相关蛋白Cyclin D1、LRP6的表达水平均明显低于siRNA-control组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表3）

表3 A549细胞中FGF 8、Cyclin D 1及LRP 6蛋白相对表达量的比较（ n= 3，±s）

表3 A549细胞中FGF 8、Cyclin D 1及LRP 6蛋白相对表达量的比较（ n= 3，±s）

组别siRNA-control组siRNA-LRP6组t值P值FGF8 1.12±0.13 0.33±0.06 9.557 0.001 Cyclin D1 2.64±0.21 1.02±0.12 11.601 0.000 LRP6 1.86±0.22 0.26±0.03 12.481 0.000

3 讨论

肺癌是世界上发病率及病死率最高的恶性肿瘤之一，主要包括两种类型，分别是小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[12]。SCLC占所有肺癌的15%～20%，其更具侵略性，通常在早期已经发生转移[13]；而NSCLC占所有肺癌的80%～85%，并可进一步分为腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和各种混合型癌，大多数NSCLC患者被诊断时已经处于晚期，仅有约11个月的中位生存期[14-15]。

越来越多的证据表明，Wnt途径是维持肺动态平衡的主要信号途径之一，其异常激活可能与多种衰弱性肺疾病有关[12]。类似于其他恶性肿瘤，Wnt信号在肺癌的发生中发挥着重要的作用。以往研究表明，LRP6参与了肿瘤细胞的调控，在口腔癌中，LRP6是一个潜在的预测靶标[10]。此外，LRP6也可通过改变β-catenin亚细胞的分布来促进人纤维肉瘤HT1080细胞的增殖[16]。有研究已证实，LRP6是Wnt/β-catenin信号通路的重要共激活因子，LRP6可与Wnt配体结合，进而促进Wnt/β-catenin信号转导[17-18]，其机制是LRP6可募集axin至细胞膜上，进而增加β-catenin的稳定性，并促进其核易位，通过与LEF-1/TCF转录因子作用，从而促进Wnt/β-catenin通路下游基因转录[19]。有研究显示，临床样本中，FGF8高表达与肿瘤的进展有关，并预示着某些恶性肿瘤（包括前列腺癌和乳腺癌）预后较差[12]。LRP6是Wnt/β-catenin通路的重要共激活因子，而Wnt/β-catenin 通路又可调节 FGF8的表达[10]，猜测在肺癌中，LRP6也可能通过FGF8信号促进肿瘤的发生、发展。

在口腔癌细胞中，LRP6是Wnt/β-catenin通路的重要共激活因子，而Wnt/β-catenin通路也可调控FGF8的表达，FGF8是Wnt通路的下游基因[10]。研究发现，FGF8在正常成人组织中表达较低，但在胚胎发育期间及包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌在内的几种激素恶性肿瘤中广泛表达，FGF8可在胚胎发育过程中介导胚胎上皮细胞向间质细胞方向转化，进而参与原肠胚形成、早期分化和脑、四肢和肾脏的形成[20-21]。在细胞培养和转基因动物模型中，FGF8能够促进乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌肿瘤的发生，其可通过自分泌和旁分泌循环促进肿瘤的生长和血管的生成，赋予多种肿瘤细胞恶性表型[22]。FGF-8可以增强体外前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力，并促进体内骨转移[23]；在小鼠乳腺肿瘤细胞中，过表达FGF8可诱导细胞上皮间质转化（epithelial interstitial transformation，EMT）和贴壁自主生长，并加速体内肿瘤的生长[24]。然而，FGF8在肺癌中的作用机制仍未完全阐明，猜测在肺癌中，LRP6也可能通过FGF8信号发挥促进肿瘤发生、发展的作用。

本研究发现，LRP6在正常肺细胞CCD-19Lu中呈低表达，而在肺癌细胞株中普遍呈高表达；且沉默LRP6可明显抑制肿瘤细胞的增殖和克隆形成能力，作用机制可能与FGF8信号及其下游增殖相关蛋白的表达有关。本研究首次报道了LRP6通过调节FGF8信号对肺癌细胞增殖的影响，LRP6可能是诊断治疗肺癌的潜在分子靶标。

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