刘锐， 种晓丹， 赵昕， 陆仁飞， 孙嘉遥， 黄新祥

(1. 江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013； 2. 海军军医大学转化医学研究院肿瘤研究所， 上海 200433)

伤寒沙门菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S. Typhi)主要通过污染的食物和水传播[1]。S.Typhi进入机体后，通过胃、十二指肠，最终侵入小肠的肠黏膜[2-3]。最近几年，在细菌中鉴定出大量的非编码RNA，其对细菌的表型起着重要的调节作用，比如动力、生物膜形成和毒力等。我们前期对伤寒沙门菌进行高通量测序和转录组分析，发现了许多非编码RNA，如flhDC基因对侧编码的疑似非编码RNA，并将其命名为AsfD(未发表)。在本研究中，我们先后通过RNA印迹，RT-PCR和cDNA 5′末端快速扩增实验(5′rapid amplification of cDNA ends，5′RACE)鉴定AsfD的长度，最后通过qRT-PCR检测AsfD在不同生长时相和环境应激条件下的表达量变化。

1 材料与方法

1.1 材料

S.Typhi野生株GIFU 10007由本实验室保存。NaCl、NaOH、HCl、无水乙醇、异丙醇均购于上海国药公司；反转录试剂盒、DL2000 Marker、rTaqDNA聚合酶、5′RACE试剂盒(大连TaKaRa公司)；DIC Northern试剂盒(Roche公司)；质粒提取试剂盒购于上海生工公司；RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)。

PCR仪(ABI公司)；荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)；核酸紫外检测仪(Thermo公司)；核酸杂交仪(Roller-Blot公司)。

1.2 引物

根据S．Typhi全基因组序列，设计特异性引物序列送苏州泓迅进行合成，引物序列及用途详见表1。

表1 引物名称及序列

1.3 细菌培养

过夜培养S. Typhi野生株，次日以1 ∶100的比例接种到LB培养液中，于37 ℃，250 r/min振荡培养，每培养一段时间检测细菌时相，直至生长到需要的时相，D(600nm)值分别为0.4、1.0、2.0。为模拟细菌环境应激，在D(600 nm)=0.4的菌液中分别加酸(HCl，pH=4.5)，氧(H2O2， 4 mmol/L)和盐(NaCl，0.3mol/L)，应激30 min。收集培养液中的细菌，用Trizol法提取细菌总RNA，用DNA酶Ⅰ去除残留DNA，通过核酸紫外检测仪检测RNA浓度。……