高丽娟,曹 夏

(1山西医科大学生理学系,太原 030001;2山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室;3山西医科大学基础医学院;*通讯作者,E-mail:gaolijuan913@126.com)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球高发恶性肿瘤之一[1]。近几年欧美等发达国家的发病率和死亡率已显著降低,然而中国胃癌的新发病例数依然居于全球首位,而且总体生存率明显低于国外,这和胃癌早期症状十分不明显有极大的关系。大多数患者出现临床症状时已进入进展期,而且早期的临床表现常与胃炎混淆,导致大多数胃癌患者已至进展期或者晚期也没有明显的临床症状出现,如此看来,简单依靠临床表现来诊断胃癌显然无法实现,有必要提高早期诊断手段。

胃腺癌(stomach adenocarcinoma,STAD)是胃癌的一种,由胃腺体细胞恶变而来,其发生率高达胃恶性肿瘤的95%,大多数胃腺癌患者确诊时已处进展期或晚期,外科切除手术已作用不大,5年术后生存率低于30%,而早期胃腺癌患者术后5年生存率高于90%,这说明早期诊断、早期治疗对胃腺癌治疗的重要性[2]。本研究首次基于R语言对TCGA数据库中胃腺癌数据进行分析,经过筛选得到与预后密切相关的生存基因,为胃腺癌的早期分子诊断提供有效的判断标准。

1 材料和方法

1.1 主要材料

TCGA(The Cancer Genome Atlas,https://cancergenome.nih.gov/)数据库是美国政府发起的癌症和肿瘤基因图谱计划,该数据库包含了丰富的肿瘤数据,本研究选择STAD数据,并下载RNA-seq数据,获得32个正常样本和375个胃腺癌样本数据及其临床数据信息。

1.2 差异基因的筛选方法

本研究中数据主要采用R语言edgeR包进行数据分析,edgeR包是bioconductor中专门用于处理RNA-seq数据的基于R语言的软件包,可对基因数据进行处理、分析。差异基因的筛选条件为差异倍数FC>1,P<0.05。

1.3 GO和Pathway富集方法

使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在线基因注释软件对差异基因进行Gene Ontology(GO)功能和Pathway生物通路富集分析,FDR<0.01为筛选条件。

1.4 预后基因的分析方法

Cox比例风险回归模型主要用于肿瘤和其他慢性病的预后分析,通过检测高低风险基因,可以预测病人的生存率。本研究使用R语言中survival包对差异基因进行Cox生存分析,筛选出与该疾病预后密切相关的基因。

1.5 作图方法

火山图、热图、GO富集图以及生存曲线的作图采用R语言ggplot2包绘制,KEGG网络图采用Cytoscape软件绘制。

2 结果

2.1 差异基因的筛选结果分析

通过R语言edgeR包对差异基因进行筛选,得到1 634个差异基因,其中上调差异基因857个,下调差异基因777个(见图1)。

2.2 GO富集结果及分析

GO分析发现差异基因主要集中于消化吸收(GO:0007586),细胞外基质蛋白(GO:0005578),激素活性(GO:0005179),角质化包膜(GO:0001533),结构分子活性(GO:0005198),表皮发育(GO:0008544),蛋白质水解(GO:0006508),肽交联(GO:0018149)等(见图2)。

图中每个点代表一个基因,其中红点表示上调差异基因,绿点表示下调差异基因,黑点表示无差异基因图1 胃腺癌差异基因的火山图Figure 1 Volcano plot of the differentially expressed genes in STAD

红点表示上调差异基因,蓝点表示下调差异基因图2 差异基因的GO富集分析Figure 2 Gene ontoloy(GO) function analysis of differentially expressed genes

2.3 Pathway富集结果及分析

Pathway通路分析发现差异表达基因主要集中在细胞色素P450对有害物质的代谢(hsa00980),化学致癌(hsa05204),脂肪消化与吸收(hsa04975),甾类激素的生物合成(hsa00140),蛋白质的消化与吸收(hsa04974)等生物通路(见图3)。

2.4 Cox分析结果及预后基因的分析

经过R语言survival包对差异基因进行Cox分析,筛选到两个与胃腺癌预后密切相关的基因ATAD2和SERPINE1(见图4),从图中生存曲线可以看出这两个基因与胃腺癌的生存率显著相关(P<0.05)。

2.5 ATAD2和SERPINE1基因在不同研究中的表达情况分析

通过Cox分析发现,ATAD2与SERPINE1对胃腺癌的预后有显著影响,ATAD2和SERPINE1基因的高表达患者总体死亡率较高,低表达的患者预后较好。结合Oncomine数据库中其他人对这两个基因的研究,进一步证实ATAD2和SERPINE1基因在胃腺癌中的表达情况,Oncomine数据库中ATAD2的表达情况(见图5),SERPINE1的表达情况(见图6)。

3 讨论

本研究对TGCA数据库中胃腺癌数据进行了深入分析,经过差异基因的初步筛选和深入分析获得两个与胃腺癌密切相关的基因ATAD2和SERPINE1,证明了胃腺癌的发生与相关基因的表达水平密切相关,并进一步深入分析了ATAD2和SERPINE1基因与胃腺癌的发生及预后的关系。

ATAD2(ATPase family,AAA domain containing 2)是三磷酸腺苷酶家族蛋白2,又称ANCCA(AAA+nuclear coregulator cancer-associated),具有组织、细胞分布以及发育时期的特异性,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生、发展等生理、病理过程[5],已有相关研究证明ATAD2基因在癌症细胞中高表达,ATAD2基因的抑制研究是未来治疗癌症的一个药物靶点,特别是直接针对ATAD2溴域(BRD)的研究可能是一项非常具有挑战性的目标,目前已陆续有研究针对次结构域开发小分子药物来治疗该疾病[6]。除此之外,有研究者对其表达与肿瘤发生相关性做了较多的研究,Zhang等[7]通过qRT-PCR和免疫组化的手段验证了胃癌中ATAD2基因的mRNA和蛋白都有高表达,并且证明ATAD2的过度表达与临床分期、肿瘤深度、淋巴结转移和远处转移密切相关,验证了ATAD2蛋白质过度表达是胃癌患者的独立预后因子,这项研究与本研究的分析结果一致,进一步证明了结果的可靠性。Wu等[8]研究证明了ATAD2在肝癌组织中的高度表达,ATAD2与MYC(Myc proto-oncogene protein)原癌基因共同调节SMO(smoothened homolog)和Gli(transcriptional activator GLI3)基因的表达,从而激活Hh通路及其反馈通路。Zheng等[9]证明子宫颈癌组织中ATAD2高度表达与肿瘤分期、淋巴结状况有关,通过减少HeLa细胞和SiHa细胞中ATAD2的表达,减少了肿瘤的入侵和迁移能力,并抑制细胞的生长和克隆能力,证明癌基因ATAD2在子宫颈癌的扩散、入侵和迁移中扮演重要的角色,可作为一种预后标志和治疗宫颈癌的治疗靶点。Luo等[10]证明在直肠癌患者中ATAD2基因的过度表达有不良的预后,并证明ATAD2的高表达与肿瘤大小、血清CEA、淋巴结转移、肝转移、临床分期密切相关,可作为直肠癌的预后标志和治疗靶点。除此之外,ATAD2在非小细胞肺癌[11]、前列腺癌[12]中也均有研究,可见该基因与肿瘤发生的密切相关性。

浅蓝色方框表示KEGG通路,椭圆内基因表示汇集在该通路上的差异基因,其中红色表示上调差异基因,黄色表示下调差异基因图3 差异基因的Pathway通路分析Figure 3 Pathway analysis of differentially expressed genes

图4 ATAD2基因和SERPINE1基因的表达对总生存期的影响Figure 4 The expression of ATAD2 and SERPINE1 effect on the overall survival

图5 ATAD2基因在正常组织和癌症组织的表达Figure 5 The expression of ATAD2 in normal tissue and cancer tissue

SERPINE1基因在D’Errico等[3]研究的混合型胃腺癌组织中表达量高于胃黏膜(正常)组织图6 SERPINE1基因在正常组织和癌症组织的表达Figure 6 The expression of SERPINE1 in normal tissue and cancer tissue

纤溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1,SERPINE1)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂[13],是组织型电浆素原激活剂(PLAT)和尿激酶型质原激活剂(PLAU)的抑制因子,其作为PLAT抑制剂,主要负责纤维蛋白溶解下调以及纤维蛋白溶解过度所致出血性疾病[14],而作为PLAU抑制剂,主要参与调控细胞黏附和扩散[15]。除此之外,SERPINE1基因与肿瘤基因激活有关[16],目前在食管癌[17],直肠癌[18],子宫内膜癌[19],头颈肿瘤[20]等癌症中已均有研究,并且SERPINE1基因的高表达在这些癌症中有较差的预后。但是关于SERPINE1基因表达与胃癌的具体研究还需进一步验证。

胃腺癌发病是一个复杂的过程,除了与预后基因的高表达相关外,与miRNA,lncRNA[21],甲基化水平[22]都密切相关。本研究对胃腺预后基因进行了分析研究,为该疾病的分子标志物筛选和靶向用药研究提供了一定的参考信息。

参考文献：

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