徐启明吴南,2,3陈易新崔丽嘉牛宇辰李孝鑫沈建雄,2,3仉建国,2,3吴志宏邱贵兴,2,3**

（1.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院骨科，北京100730；2.北京市骨骼畸形遗传学研究重点实验室，北京100730；3.中国医学科学院骨科研究中心，北京100730；4.中国医学科学院阜外医院，北京100037；5.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院内分泌科，北京100730；6.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室，北京100730）

脊柱侧凸是一种发生于脊柱的三维畸形，其特征是脊柱侧凸角度（Cobb测量法）＞10°并伴有椎体的旋转畸形[1]。脊柱侧凸可分为先天性脊柱侧凸、继发性脊柱侧凸和特发性脊柱侧凸（idiopathic scoliosis,ⅠS）。其中，先天性脊柱侧凸指由胚胎期脊柱发育畸形导致的脊柱序列偏移，如未分节骨桥、半椎体及楔形椎等畸形等[2,3]；继发性脊柱侧凸指有明确病因的脊柱序列偏移，如肌萎缩、脊髓灰质炎、肌强直等[4,5]；ⅠS指既无胚胎期脊柱畸形也无其他明确病因的脊柱侧凸。其中，青少年特发性脊柱侧凸发病于10~16岁，是最多见的ⅠS，占所有脊柱侧凸的80%[1]。与继发性脊柱侧凸比较，先天性脊柱侧凸和ⅠS的病因及发病机制尚不明确，导致相关脊柱侧凸的预防、早期诊断及治疗存在较大难度。

目前已有大量针对ⅠS病因学的研究，其中有些研究[6,7]提示，遗传因素可能在ⅠS的发病过程中起着重要作用。ⅠS的家族聚集性发病在特发性脊柱侧凸中占有较高的比例[8-12]，提示ⅠS具有一定的遗传特性。ⅠS的遗传模式不详，其可能受到易感基因和环境因素的双重调控[13]。尽管也有报道认为存在ⅠS的单基因亚型，然而用于证明这些单基因遗传模式的大型ⅠS家系的数量极少，导致ⅠS的单基因遗传模式难以复制和验证。近期，越来越多的学者[14,15]认为，ⅠS的发病过程受到不同基因位点的等位基因影响。有些研究[16]发现某些基因位点在ⅠS患者中具有显性遗传特性，包括5q13-q14、3q11-q13、9q34、17q25、17q25、18q 和19p13.3等。另外，一些全基因组关联性研究（genomewide association studies,GWAS）成功地确定ⅠS的新发易感基因，包括G蛋白受体-126（protein-coupled receptor 126,GPR126），瓢虫同源框-1（ladybird homeobox 1,LBX1），成对盒基因-1（paired box 1,PAX1），锌指结构蛋白碱核蛋白-2（zinc finger protein basonuclin 2,BNC2），以及中心粒蛋白体-5（proteome of centrioles 5,POC5）[17-21]。Liu等[7]在中国北方汉族青少年ⅠS患者中检测到2个LBX1基因附近的SNP，并使用荧光素酶技术证实了其中的1个SNP能够下调LBX1信使RNA反义RNA的转录，从而提高LBX1基因的功能。Liu等[22]在中国北方汉族青少年特发性脊柱侧凸患者中检测到3个与之明显关联的GPR126基因SNP，并发现其中2个SNP和青少年特发性脊柱侧凸协和分型（PUMC classification）之间存在相关性。然而，这些研究并没有完全解释特发性脊柱侧凸的病因学机制[6,23]。

Patten等[21]最近成功地将ⅠS的致病性基因定位在染色体5q13.3或3q12.3，并在ⅠS患者中检测到产生功能的POC5基因突变。他们通过对3个ⅠS家系和8个ⅠS散发患者的基因测序，报道了3个位于POC5基因第10外显子[参考序列号：NM_001099271]上的错义突变位点，分别是c.C1286T（p.A429V）、c.G1336A（p.A446T）和c.G1363C（p.A455P），进一步功能验证实验表明上述突变可以导致斑马鱼的脊柱产生轻、中、重度不同比例的侧凸畸形。他们在基因层面上关于ⅠS病因学的研究成果具有突破性进展，然而只是局限于高加索人群。在此基础上，Xu等[24]对大样本中国人群青少年特发性脊柱侧凸患者进行POC5基因报道的上述3个阳性位点进行测序分析，并未发现Patten等报道的3个突变位点或其他新发罕见突变位点。进一步针对该区域的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）关联分析发现，rs6892146位点可能与ⅠS相关（患者vs对照：1446 vs 2080，P=0.004）。常见SNP和罕见突变都可能对疾病的遗传性有贡献[25,26]。为了检测中国人群脊柱侧凸患者中是否存在POC5基因的罕见变异，我们对中国汉族人群患者进行基因测序。

1 资料与方法

1.1 临床资料及纳入、排除标准

本研究经北京协和医院伦理委员会批准，选取2010年10月至2017年10月于我院住院并诊断为ⅠS的121例中国汉族患者纳入研究，其中男性23例，女性98例，发病年龄1~22岁，平均12.7岁。所有患者均签署知情同意书。纳入标准：明确诊断为脊柱侧凸的患者，包括体格检查中的前屈试验（Adam试验）阳性，且全脊柱X线片显示脊柱侧凸度数（Cobb测量法）＞20°并伴有椎体旋转（高于ⅠS的诊断标准，为了避免因环境因素引起的拟表型）。对于侧凸度数＞20°但不伴有椎体旋转者，可能伴有潜在的椎体畸形或系椎间盘突出等引起的脊柱侧凸，视为非典型侧凸而不予纳入。

排除标准：①先天性脊柱畸形者（未分节骨桥、半椎体及楔形椎等畸形）；②神经肌肉型脊柱侧凸（Duchenne肌萎缩、Friedrich共济失调、神经纤维瘤病、脑性瘫痪、脊柱裂、脊髓灰质炎、肌强直等）；③外伤性脊柱侧凸；④退行性脊柱侧凸；⑤脊柱侧凸合并其他系统疾病者（如Goldenhar综合征，Klippel-Feil综合征，Freeman-Sheldon综合征，Marfan综合征，Larsen综合征等）。

选取50名与实验组无相关性的健康中国汉族人群作为随机对照组。纳入标准：①体格检查中的前屈试验（Adam试验）阴性，且全脊柱X线片显示脊柱无侧凸；②经检查除外有骨骼系统遗传性疾病及其他系统疾病。

1.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）及结果分析

用Puregene 158389血液提取工具（Qiagen公司）从外周静脉血中提取全基因组DNA。首先，从实验组中随机抽取10例中国汉族ⅠS畸形患者，用FastStart聚合酶链反应（Roche公司）及外部引物（表1）对其POC5基因的所有外显子进行扩增，随后用同样的方法对剩余的111例患者和50名对照组受试者POC5基因的第10外显子进行序列扩增。具体实验步骤如下：45°C 30 min，94°C 2 min，（94°C 30 s，50°C 30 s，72°C 90 s）×35循环，72°C 10 min。最终的PCR产物经电泳检测符合参考序列的分子量，并对基因序列进行正向及反向Sanger测序。使用CodonCode Aligner 6.0.2软件对DNA测序结果进行分析[参考序列号：NM_001099271]。

表1 用于POC5基因扩增的引物序列

2 结果

在Patten等的研究中，3个POC5基因突变位点在ⅠS中的致病性通过基因测序及斑马鱼功能验证得到了证实，然而在中国汉族人群中并未发现这些突变位点。我们在2个ⅠS患者的POC5基因第10外显子中检测到另外2个未经报道的罕见错义突变位点，分别是c.C1139T（p.S380F）和c.A1132T（p.Ⅰ378L）（图1），而在对照组中未发现POC5基因第10外显子的基因突变。c.C1139T（p.S380F）突变导致密码子TCC（丝氨酸）转变为密码子TTC（苯丙氨酸），c.A1132T（p.Ⅰ378L）突变导致密码子ATA（异亮氨酸）转变为密码子TTA（亮氨酸）。通过检索NCBⅠ的dbSNP数据库，显示c.A1132T（p.Ⅰ378L）在千人基因组计划和ExAc数据库中无相关报道；虽然c.C1139T（p.S380F）在千人基因组计划和ExAc数据库中有过报道（rs141696191），但其在ExAc数据库的等位基因频率仅为0.001402，提示为罕见突变，可能具有致病性。

根据测序结果，回顾c.C1139T（p.S380F）和c.A1132T（p.Ⅰ378L）两个POC5基因错义突变的ⅠS患者病历，并总结其主要病例特点（表2）。2个女患者都是在14岁被诊断为ⅠS，无明确的脊柱侧凸致病原因或相关家族病史。其中突变c.A1132T（p.Ⅰ378L）对应的患者脊柱存在主胸弯及胸腰弯，侧凸Cobb角分别为64°及87°，顶椎分别位于T6及L1水平。c.C1139T（p.S380F）对应的患者脊柱存在上胸弯及主胸弯，侧凸Cobb角分别为53°及58°，顶椎分别位于T2/3及T9/10椎间盘水平。2例患者在就诊时都存在较大的生长潜能，侧凸度数较大且具有进一步发展的可能，均接受了脊柱后路矫形、植骨融合内固定术，手术过程顺利，术后矫形效果良好。

3 讨论

ⅠS可能是一个受到多基因影响的疾病。研究者们曾经试图通过全基因连锁分析，在ⅠS和某些基因之间寻找到关联性[16,27,28]，然而迄今为止尚未取得成功。进而，全基因组关联性研究（genome-wide association studies,GWAS）被用于比较某些特异性基因多态性在实验组和对照组之间的差异性，以筛选其中可增加ⅠS易感性的特异性基因多态性[19,20,29]。Patten等的报道表明，POC5基因变异在家系及散发患者中均有存在，并利用转基因技术基于突变位点成功构建出斑马鱼动物模型。Xu等[24]首先报道了POC5基因突变和中国人群青少年ⅠS的相关性研究，然而他们并没有发现Patten等在高加索ⅠS人群中发现的POC5基因罕见变异或其他新发突变。他们进一步发现SNP（rs6892146）的表达在ⅠS人群和健康人群中有显著差异，但该SNP位于POC5的内含子区域。Xu等认为其可能作为增强子促进了POC5基因的转录，进而对脊柱侧凸的发病过程产生作用，但和位于外显子的罕见突变位点比较，SNP变异rs6892146对疾病的遗传贡献目前不详。

图1 POC5基因错义突变位点在ⅠS患者中的分布情况

尽管本研究也未检测出Patten等在高加索ⅠS患者中报道的POC5基因突变，但值得注意的是，我们首次在中国汉族人群ⅠS患者中检测出POC5基因第10外显子上的2个罕见变异。此外，我们还对随机抽取的10例患者的DNA样本进行POC5基因的全部外显子测序，未发现在第10外显子之外的外显子部位存在变异。本研究报道的突变位点和Patten等报道的突变位点都位于POC5基因的第10外显子，且前者集中于第10外显子的起始端，后者集中于中、末端。这些突变位点在第10外显子上的非随机分布（图1），提示第10外显子对应的POC5蛋白质结构可能在脊柱发育过程中发挥重要的作用。虽然本研究检测到POC5基因的罕见变异尚不能直接得出其对脊柱侧凸的致病性，但为POC5基因和ⅠS关联性的进一步研究锁定在第10外显子提供了新的依据。

POC5基因所表达的中心粒蛋白体-5是一种中心粒结合蛋白，其位于中心粒中并在中心粒成熟、细胞分裂和极化过程中起到重要作用，POC5是人类中心粒的远端部分的必需组成部分。在分裂前期/分裂期（G2/M）临界节点，POC5转化成中心粒前体以促使中心粒的成熟[30]。研究[30]表明POC5缺失细胞在G1期停止或细胞死亡。既然POC5对于细胞进入分裂前期（G2）期起着关键作用，我们有理由相信它可能生长和发育过程中也起着重要作用。有研究[31]发现，POC5功能异常和哺乳动物的纤毛相关疾病相关，提示其也可能影响骨骼系统的发育。ⅠS的度数进展和骨的不均衡生长有关。POC5在细胞分裂和增殖中起着重要的作用，因此，我们有理由推测POC5结构和功能受到任何的紊乱可能在骨发育过程中引起椎体生长的失调，进而导致脊柱序列在冠状面出现弧度。虽然Pattern等[21]通过与人类基因高度同源的斑马鱼实施了功能验证实验，认为POC5的变异可能导致脊柱侧凸，我们认为构建哺乳动物的POC5基因突变导致脊柱侧凸的动物模型或许会对POC5对ⅠS的贡献提供进一步的证据。

本研究仅随机选取10例患者POC5基因的全部外显子进行测序以初步验证我们的猜测。在条件允许的情况下，我们将在今后的研究中对所有样本的POC5基因进行全外显子测序。另一方面，我们当前的假设是疾病的表型和基因的外显子而非内含子相关，正是基于这个假想我们才只对POC5基因的外显子进行测序。内含子是否在脊柱侧凸的发展过程中起作用尚有待证实。ⅠS是一个有多基因背景的复杂骨骼畸形，POC5基因突变是否在ⅠS发病过程中起决定性作用，还有待于利用全外显子组测序技术(whole exome sequence,WES)排查ⅠS患者是否在POC5基因突变之外存在其他导致骨骼畸形的基因变异。此外，对POC5突变基因所编码的蛋白进行三维结构解析，更有助于说明相应突变导致的蛋白结构及功能改变在脊柱侧凸的发生发展过程中所起的作用。本研究中发现中国汉族人群ⅠS患者中存在POC5基因的错义突变，与以往文献中的报道不同，为POC5突变与ⅠS的发病相关性提供了新的证据。进一步验证还需要多中心、更大样本的筛查，以及细胞学与动物模型的构建等相关工作。

表2 携带POC5基因第10外显子错义突变位点的2例ⅠS患者的临床信息

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