丁泽红， 付莉莉， 吴春来， 胡 伟

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 571101)

海藻糖是由2个葡萄糖分子通过α-1，1糖苷键结合而成的非还原性双糖[1]。海藻糖具有生物抗逆性，其含量在干旱、低温、氧化和热胁迫等条件下被大量积累[2]，可以在非生物胁迫下保护核酸、蛋白质、细胞膜等生物大分子物质，从而增强植物的抗逆性[3-4]。海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase，简称TPS)是海藻糖生物合成途径中的一个关键酶，即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖在TPS催化作用下生成6-磷酸海藻糖，之后在海藻糖-6-磷酸酯酶的水解作用下生成海藻糖[5]。在大多数植物中，海藻糖的含量非常低(鲜质量含量<10 μmol/g)，但是通过调节TPS基因的表达可以提高海藻糖的含量并且不影响植株生长[6]。将拟南芥AtTPS1基因转入烟草后，转基因植株体内海藻糖含量显著增加，其耐受盐胁迫的能力显著增强[4]。在干旱、低温和高盐条件下，水稻OsTPS1转基因植株抗性明显增强，与对照相比，转基因植株体内海藻糖含量约增加了2倍[3，7]。TPS基因的表达受到干旱、低温、遮阴等非生物胁迫的调控。在低温胁迫条件下，茶树CsTPS、辣椒CaTPS、小麦TaTPS的表达量显著增加[8-10]；在干旱胁迫条件下，棉花GhTPS和海带SjTPS的表达量显著增加[11-13]；在遮阴胁迫条件下，玉米TPS基因的表达量也发生了显著变化[14]。此外，TPS基因的表达量在植物的不同组织中也不尽相同，呈现出差异表达的特点[8-9]。这些研究充分表明，TPS是一个重要的抵御干旱、低温等非生物胁迫的候选基因，提高其表达水平可以增强植物的抗逆性。

木薯是大戟科块根植物，是热带、亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。木薯具有较好的抗旱特性，然而在长时间或较为严重的干旱条件下，其块根产量会显著下降[15-16]。除了干旱，木薯产量还常常受到低温、遮阴等环境因素的影响。作为典型的热带作物，木薯对低温胁迫非常敏感，极端的低温天气可造成木薯产量大幅减少甚至绝收[17]。此外，由于长期受耕作方式的影响，在某些经济落后的地区(如拉丁美洲)，农民常常将木薯和橡胶树、玉米等作物间作在一起，以达到土地使用效率的最大化。在这种情况下，木薯经常会受到不同程度的遮阴，其产量也会显著减少[18-19]。因此，提高木薯对干旱、低温、遮阴等非生物胁迫的耐受性，使其在恶劣环境下维持原有块根产量，或是减少产量的损失具有重要意义。

至今，尚没有关于木薯TPS基因克隆及其参与非生物胁迫调控的报道。本研究采用同源基因克隆的方法从木薯叶片中克隆了1个海藻糖合成酶基因(命名为MeTPS1)，之后从进化树、保守结构域和启动子元件等方面对其进行初步的生物信息学分析，同时研究其在不同组织之间，以及在干旱、低温、遮阴和脱落酸(ABA)胁迫处理下的表达模式，为进一步研究MeTPS1的功能奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用木薯材料为木薯栽培品种Ku50，它具有高产、高淀粉含量的特性，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。RNA提取试剂盒(货号：DP437)，购自天根生化科技(北京)有限公司；cDNA反转录试剂盒(货号：K1622)，购自Fermentas公司。

1.2 木薯种植与处理

木薯种植按照Ding等的方法[19-20]进行：在木薯种植季节(2013年5月)，将木薯种茎切成长度约15 cm的茎段，挑选粗细均匀一致且具有3～4个芽眼的茎段扦插于塑料盆(高18.8 cm，上直径18.5 cm，下直径14.8 cm)中，每盆1个茎段。基质采用营养土与蛭石以体积比1 ∶1进行混合。木薯种植约10 d后进行间苗，保留1株/盆。试验地点为中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

PEG处理：种植60 d后，选取长势一致的植株，用20% PEG 6000溶液进行模拟干旱处理，同时以不施PEG(浇灌自来水)的植株为对照。在处理0、3、24 h后，分别收集未展开叶、第1张完全展开叶、老叶和根的样品，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

低温处理：种植60 d后，选取长势一致的植株放置于光照培养箱内，进行4 ℃低温胁迫处理。在处理0、6、24 h后，分别收集未展开叶、第1张完全展开叶和根的样品，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

ABA处理：种植60 d后，选取长势一致的植株，采用 100 μmol/L ABA溶液进行浇灌处理，在处理0、3、5、7 d后收集第1张完全展开叶的样品，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

遮阴处理：将遮阴处理的木薯种植于橡胶树下，将对照处理的木薯种植于室外。种植60 d后，选择生长状况较一致的植株，收集未展开叶、第1张完全展开叶和老叶的样品，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

为了比较不同组织中MeTPS1基因的表达情况，笔者还收集了木薯Ku50叶片、叶柄、茎、须根和储藏根的样本，用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，简称qRT-PCR)分析。

1.3 引物合成及qRT-PCR

采用Primer 6.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，包括actin基因引物(L1：5′-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3′；R1：5′-CCTCCTACG ACCCAATCTCA-3′)[21]、MeTPS1基因qRT-PCR引物(L2：5′-TAGACACTCCTGGGCGAAGA-3′；R2：5′-CTGCC AGCCACATGTCAAAC-3′)和MeTPS1基因全长扩增引物(L3：5′-ATGCCTGGAAACC AGTACAACA-3′；R3：5′-TCAAGGAGATGCATTGGCT-3′)。采用RNA提取试剂盒抽提木薯总RNA，之后用cDNA反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，-20 ℃储存备用。用SYBR Green Ⅰ试剂盒(TaKaRa公司)，按照操作说明在Mx 3005P荧光定量PCR仪(Stratagene，美国)上进行qRT-PCR分析。每个样品设3次生物学重复，表达量按照2-ΔΔCT计算[22]。

1.4 生物信息学分析

用ExPASy ProtParam软件分析蛋白质的分子量和等电点；用Plant-mPLoc软件预测亚细胞定位情况；用NCBI-CDD数据库分析保守结构域；用BLASTp搜索Phytozome数据库，获取其他物种与MeTPS1同源的蛋白质序列；用ClustalX进行序列比对；用MEGA5.2软件构建进化树；用PlantCARE进行启动子元件分析。

2 结果与分析

2.1MeTPS1基因克隆

用拟南芥AtTPS1基因(登录号：At1g78580)的蛋白质序列进行BLASTp搜索Phytozome数据库，获得其在木薯中的同源序列(cassava4.1_001223m)，之后设计引物进行PCR扩增(图1)。测序后获得1个全长为2 781 bp的序列，编码926个氨基酸(图2)，根据该序列与拟南芥TPS基因的同源性，将其命名为MeTPS1。经序列比对，发现MeTPS1与参考序列之间共存在3个碱基差异，其中1个为非同义突变(图2)。将MeTPS1与基因组序列比对得知，该基因含有17个外显子和16个内含子。ProtParam理化性质预测MeTPS1蛋白质的分子式为C4 639H7 296N1 314O1 382S32，分子量为104 614.86 u，理论等电点(pI)为6.34，不稳定系数为49.05，属于不稳定蛋白。亚细胞定位预测结果显示，该蛋白质定位于叶绿体。蛋白质保守结构域分析表明，MeTPS1编码的蛋白含有TPS家族保守结构域(Glyco_transf_20，图3)，进一步表明克隆得到的基因为木薯MeTPS1基因。

2.2 MeTPS1基因进化树分析

采用BLASTp同源比对的方法，笔者获取了其他物种中与MeTPS1同源性较高的蛋白质序列。系统进化树分析表明，这些基因大体上可以被分为3组：第Ⅰ组以C4物种为代表，包括谷子、狗尾草、玉米、高粱、黍羊、柳枝稷和二穗短柄草；第Ⅱ组以杨柳目的物种为代表，包括木薯、杨树和杞柳，因此MeTPS1与其在杨树(Potri.011G103900.2)、杞柳(SapurV1A.0026s0140.6)中同源基因的亲缘关系较近，序列相似性分别为88.1%、89.4%；第Ⅲ组以十字花科的物种为代表，包括白菜型油菜、拟南芥、荠菜花、琴叶拟南芥和鼠耳芥(图4)。

2.3 MeTPS1基因启动子元件分析

启动子是控制基因转录起始时间和表达程度的重要组成部分。本研究选取MeTPS1起始密码子上游1 500 bp的序列进行启动子元件分析，发现了一些与胁迫相关的元件，如干旱诱导元件MBS、热胁迫响应元件HSE、以及防御和胁迫响应元件TC-rich repeats(表1)。除此之外，笔者还发现一些与激素相关的元件，如赤霉素响应元件GARE-motif、水杨酸响应元件TCA-element、生长素响应元件TGA-element，以及与光响应相关的元件，如ACE、Box 4和Box I等(表1)。这些结果表明，MeTPS1可能参与木薯干旱、高温/低温、 激素和光照(如遮阴)相关的基因调控。

表1 MeTPS1基因启动子元件分析

2.4 MeTPS1基因在木薯不同组织中的表达分析

前人研究表明，TPS基因在植物不同组织器官中的表达量差异很大。本研究考察了MeTPS1基因在木薯Ku50不同组织中的表达情况。结果表明，MeTPS1在叶片中的表达量最高，其次是茎、叶柄、须根和储藏根中的表达量，分别是叶片中的49%、27%、16%、5%(图5)。这些结果表明，MeTPS1基因主要在木薯的叶片中起作用，而在根(特别是储藏根)中的作用可能比较有限。

2.5 MeTPS1基因在不同胁迫条件下的表达分析

本研究分别考察了MeTPS1基因在干旱、低温、遮阴和ABA处理条件下不同组织中的表达情况。在PEG 6000胁迫条件(模拟干旱)下，MeTPS1的表达量在未展开叶中呈现先上升后下降的变化趋势， 在胁迫处理3、24 h后与处理0 d相比分别上升了30%、下降了40%；在第1张完全展开叶和老叶中，MeTPS1的表达量在3 h内均没有显著变化，而在24 h分别下降了50%和70%；在根中MeTPS1的表达量在3 h上升了60%，之后在24 h又恢复到初始水平(图6-A)。在低温胁迫条件下，MeTPS1的表达量在不同组织中也呈现不同的表达模式：在未展开叶中MeTPS1的表达量先下降后上升；在第1张完全展开叶中，MeTPS1的表达量持续上升，在低温处理6、24 h后分别上升了1.3、2.2倍；在根中，MeTPS1的表达量呈现先上升后下降的变化趋势(图6-B)。在遮阴条件下，MeTPS1的表达量在未展开叶、第1张完全展开叶中没有显著变化，但在老叶中其表达量被显著诱导了，增加了约30%(图6-C)。然而，在ABA处理3、5、7 d后，MeTPS1的表达量均没有显著变化(图6-D)。

这些结果充分表明，MeTPS1基因的表达受到干旱、低温和遮阴处理显著诱导，在木薯各组织中呈现截然不同的表达模式，但是MeTPS1基因表达量与ABA胁迫处理没有表现出必然联系。

3 讨论与结论

TPS是海藻糖生物合成途径中的一个关键酶，是植物进行遗传改良以抵御干旱、低温等逆境胁迫的一个重要候选基因。植物中TPS基因以基因家族的形式存在，绝大部分TPS蛋白都含有TPS基因家族保守结构域[14]。目前，人们已经先后从拟南芥[23]、水稻[7]、小麦[10]、棉花[12]、茶树[8]、香蕉[24-25]、辣椒[9]等多个物种中克隆了TPS基因，并对其功能进行了深入研究，但在木薯中尚没有TPS基因克隆的相关报道。本研究采用同源基因克隆的方法，从木薯叶片中克隆了1个TPS基因，命名为MeTPS1。序列分析表明，MeTPS1编码926个氨基酸，含有TPS家族保守结构域。进化树分析表明，MeTPS1与杨树和杞柳TPS基因的亲缘关系较近，序列相似性分别达到88.1%和89.4%。

许多研究表明，TPS基因在植物不同组织器官中的表达量差异很大[8-9，26]。例如，辣椒CaTPS在叶片中的表达量大约是根和茎中的5～6倍[9]；香蕉MaTPS在叶片、球茎和花中的表达量较大，而在根和果实中的表达量极少[25]；茶树CsTPS基因在花中的表达量最高，在根中的次之，其次是在茎、芽、叶和种子中的，且表达丰度仅为花的13%～41%[8]。本研究发现，MeTPS1在叶片中的表达量最高，其丰度是茎、叶柄、须根和储藏根的2～20倍，呈现出明显的组织表达特异性。这些研究结果表明，TPS基因可能在植物不同组织中扮演着不同的功能。

TPS基因的表达量受到干旱、低温、遮阴等非生物胁迫的诱导[11，14]。在干旱胁迫条件下，棉花GhTPS和海带SjTPS的表达量显著增强[11-12]；在低温胁迫条件下，茶树CsTPS和辣椒CaTPS的表达量被显著诱导[8-9]。启动子是基因表达调控的重要元件，通过对MeTPS1启动子序列分析，发现了干旱相关元件MBS、热胁迫相关元件HSE，以及许多与光响应相关的元件(如ACE、Box I、Box 4等)，从而提示MeTPS1可能参与木薯干旱、低温和光照(如遮阴)相关的基因调控。脱落酸(abscisic acid，简称ABA)是调节植物生长发育非常重要的一种激素，是植物响应干旱、低温等非生物胁迫信号的传导者[27-30]。为此，笔者分别在干旱、低温、遮阴和ABA处理条件下，在木薯不同叶片和根中对MeTPS1基因的表达模式进行详细的研究。试验结果表明，MeTPS1基因表达受干旱、低温和遮阴胁迫显著诱导，但对ABA胁迫处理没有明显反应，暗示MeTPS1参与木薯干旱、低温和遮阴胁迫反应的信号传导路径是不依赖于ABA的。这一点与MeTPS1启动子元件的分析结果是一致的，因为本研究没有发现任何与ABA响应相关的元件。这些研究结果为进一步研究MeTPS1参与木薯非生物胁迫的分子机制奠定了扎实的工作基础，同时也为木薯抗逆遗传改良工作的实施提供了重要的理论依据。

本研究克隆了1个木薯海藻糖合成酶基因MeTPS1，该基因编码926个氨基酸，含有TPS家族保守结构域，它与杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近。启动子元件分析表明，MeTPS1含有干旱诱导元件(MBS)、热胁迫响应元件(HSE)、防御和胁迫响应元件(TC-rich repeats)以及光响应元件(ACE、Box I、Box 4)等。表达分析结果显示，MeTPS1在叶片中的表达量最高，在须根和储藏根中的表达量最低。而且，MeTPS1基因的表达能被干旱、低温和遮阴胁迫处理显著诱导，但对ABA胁迫处理无明显响应。因此可见，MeTPS1可作为一个重要的候选基因应用于木薯抗逆遗传改良中。

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