姬丽娅 马妮 王新来 狄政莉 史明 李三中 吴中亮*

(空军军医大学西京医院: 1神经内科; 2神经外科，陕西 西安710032; 3西安市中心医院神经内科，陕西 西安710003)

胶质瘤因其恶性增殖、免疫逃逸、超强的侵袭和转移能力、放化疗抵抗和胶质瘤干细胞的自我更新，使得胶质瘤尤其是恶性胶质母细胞瘤的术后生存时间很短，已严重危害人类健康。如何针对胶质瘤细胞的以上特点，找出快速有效的治疗策略成为治疗胶质瘤的关键所在。本研究主要观察miR-144-3p分子在胶质瘤中的表达。

材料与方法

一、材料

1.细胞系：实验所需人源神经元细胞系HCN-2、U251胶质瘤细胞系、U87MG胶质瘤细胞系均购自ATCC细胞库，并在论文撰写人所在实验室传代保存。

2.标本收集：本实验所需胶质瘤组织均来自于西京医院神经外科胶质瘤患者，共30例，其中弥散性星形细胞瘤(WHO Ⅰ或Ⅱ级)共10例，间变性星形细胞瘤(WHO Ⅲ级)共10例，原发性胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)共10例。正常脑组织样本均来自西京医院神经外科的脑外伤患者切除组织，共30例。所有标本处理均根据西京医院的伦理和法律标准，所有参与者均签署知情同意书。

3.实验试剂及来源：RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)，DMEM ( Dulbecco's modified Eagle's medium)，胰蛋白酶，PBS(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline, PBS)均购置于GIBCO公司；胎牛血清购于杭州四季青；Trizol购于Invitrogen；逆转录试剂，实时定量PCR试剂盒购于Takara公司。

4.实验所用主要仪器及生产公司：PCR扩增仪购置于BioRad公司；组织匀浆器，琼脂糖凝胶电泳仪购于北京市六一仪器厂；超净工作台购于苏净集团安泰公司；电子天平购于Mettler-Tollede公司；超纯水制备器购于Millipore公司；紫外凝胶成像仪购于Alpha Innotech公司；台式高速低温离心机购于Beckman；生物安全柜购于Nuaire公司；恒温孵箱购于Thermo公司；实时定量PCR仪购于ABI公司；相差显微镜购于Olympus BX-51公司。

5.实时定量PCR引物序列：miR-144-3p基因引物序列为5'-TACAGTATAGATGATGTACT-3'。

二、方法

1.细胞培养及miRNA转染：U87MG和U251细胞系培养：复苏：将冻存的U87MG或U251细胞系在37 ℃水浴锅中迅速融化解冻，一边解冻一边轻轻晃动冻存管，使其均匀受热；在无菌的超净工作台中，将解冻后的细胞小心转移至离心管中，加入10 mL经37 ℃水浴锅预热的RPMI-1640培养液( Roswell Park Memorial Institute-1640)，小心、充分混匀；将细胞放入台式离心机中，12 000 r/min，离心5 min；离心完成后，在超净工作台中将上清培养液移除，用新鲜RPMI-1640培养液重悬细胞团块，小心吹打数次至单细胞悬液，将细胞接种于10 cm培养皿中；将复苏后的细胞置于5% CO2、37 ℃恒温孵育箱内培养。细胞传代：每天观察细胞生长密度和培养基颜色变化，当细胞铺满培养皿底部时，即需要传代处理，约每3 d传代一次；当细胞需要传代时，小心将培养液吸出，加入2～3 mL无菌PBS，轻轻清洗细胞后，移除PBS；在10 cm培养皿中加入1～2 mL左右胰蛋白酶，放置于孵箱中消化约3～5 min，并实时观察细胞消化情况；在培养皿中加入2～3 mL含血清培养液终止消化，吹打均匀后，将细胞悬液移至15 mL离心管中，12 000 r/min，离心5 min；离心完成后，在超净工作台中将上清培养液移除，用新鲜RPMI-1640培养液重悬细胞团块，小心吹打数次至单细胞悬液，将细胞按1 ∶4比例继续接种于10 cm培养皿中。

2.细胞及组织RNA提取：收取大约数量为1×106的胶质瘤细胞，并加入1 mL TRIzol(Invitrogen)对细胞进行消化液裂，室温静置约5 min以防止染色质-蛋白复合物形成，静止后将裂解液移入1.5 mL离心管中；若样本为肿瘤组织，则取小块组织(约0.1 g)，加入1 mL TRIzol后，用组织匀浆器进行研磨，待组织完全磨碎后，将裂解液小心吸取移入1.5 mL离心管中；在离心管中加入五分之一体积(200 μL)氯仿，盖紧盖子，将离心管置于斡旋震荡仪上剧烈震动混匀15 s后，室温静置2 min；将油相、水相分层的裂解液置于低温离心机中，转速12 000 r/min，4 ℃离心15 min；离心后溶液彻底分层，使用无RNA酶的枪头小心吸取上层水相(无色透明状)，并转入干净无RNA酶的1.5 mL离心管中，加入二分之一体积(500 μL)异丙醇，轻柔上下颠倒，使之充分混匀同时避免剧烈晃动致使染色质断裂；4 ℃静置10 min后，置于离心机中，转速12 000 r/min，4 ℃低温离心10 min；离心后可见离心管底部胶状无色沉淀，弃去废液，加入大约800 μL浓度为70%～75%乙醇进行洗涤，洗涤后进行离心，7 500 r/min，4 ℃低温离心5 min；弃去废液，并将离心管倒扣于干净滤纸上，至乙醇全部控干挥发后，加入50 μL体积无RNA酶水进行溶解并定量，放于-70 ℃保存。

3.反转录PCR：将miRNA反转录试剂盒所包含试剂进行冰上融解，上下轻柔颠倒使之混匀，短暂离心后将试剂放置冰上待用；将已进行定量的RNA样本取出，根据浓度计算所要加入的RNA的体积(反转质量约为1～5 μg)，反应体系配制为2×Reaction Buffer 10 μL，Primer(引物) 1 μL，逆转录酶1 μL，RNA 1～5 μg，RNase Free (无RNA酶)H2O补足20 μL，总量为20 μL混匀配制完成的反应混合液，将PCR管短暂离心后，放于PCR扩增仪中，反应条件如下：37 ℃反应60 min，85 ℃反应5 s灭活处理，所得到的反转录产物可使用灭菌双蒸水稀释5～10倍后，放于-20 ℃保存。实验中所使用到移液器吸头和不同规格离心管，均需要提前使用浓度0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)溶液浸没过夜，并经高压灭菌、烘干后方可使用。

4.实时定量PCR：将实时定量PCR所需试剂置于冰上融解，上下轻柔颠倒使之混匀，短暂离心后将试剂放置冰上待用；按照说明书要求，冰上配制实时定量PCR反应液，体系如下：SYBR mix 10 μL，ROX 0.4 μL，10 nM miRNA Primer 0.8 μL，10 nM Common Primer 0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase Free H2O 7 μL共20 μL混匀配制完成的实时定量PCR反应混合液，按顺序加入至PCR反应八联管中，短暂离心后，将八联管放于实时定量PCR扩增仪中。反应条件为：95 ℃预变性2 min后，进入循环；循环内95 ℃变性30 s，60 ℃反应延伸35 s，重复40个循环。检测miR-144-3p分子的表达量(Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA)，U6作为内参对照。

结 果

一、miR-144-3p分子在胶质瘤患者不同组织中的表达差异

30例脑外伤患者切除的部分组织、30例不同病理学分级胶质瘤患者的癌和癌旁组织。将不同样品提取RNA后，检测miR-144-3p分子基因的表达水平。检测结果发现，miR-144-3p在正常脑组织中表达最高，癌旁组织中的水平高于癌组织。这提示在胶质瘤组织中miR-144-3p的丰度占优势，可能会发挥更重要的作用(图1)。结果提示，miR-144-3p分子在不同组织中存在明显的表达差异。

二、miR-144-3p分子在不同病理学分级胶质瘤中的表达差异

将50例胶质瘤患者的组织标本按照其病理学分级进行了分组，分别为5例WHO Ⅰ级胶质瘤，5例WHO Ⅱ级胶质瘤，10例WHO Ⅲ级胶质瘤和10例WHO Ⅳ级胶质瘤。并在四组之间miR-144-3p的表达量做进一步统计学分析。结果如图2所示，miR-144-3p在病理学分级较低的Ⅰ或Ⅱ级胶质瘤中高水平表达，而在Ⅲ级胶质瘤中表达丰度较低，在Ⅳ级胶质瘤中表达最弱，这也与之前观察检测的结果相一致，miR-144-3p在肿瘤组织中低表达，并随着恶性程度增加而逐渐降低。

三、miR-144-3p分子在不同人源胶质瘤细胞系中的表达差异

为了进一步验证我们的结论，我们选取了不同人源胶质瘤细胞系和正常神经元细胞系，对该miRNA簇的不同分子表达水平进行鉴定检测。miR-144-3p在正常神经元细胞系中表达都远高于各组神经胶质瘤细胞系(图3)。这提示，miR-144-3p分子与胶质瘤的进展密切相关，有可能参与调控胶质瘤的发生与发展。

四、miR-144-3p的表达量与患者预后相关性

将胶质瘤患者的术后生存期与miR-144-3P表达水平进行了生存分析，结果提示，miR-144-3p的表达水与胶质瘤患者的预后呈正相关(图4)。这提示miR-144-3P分子可能在胶质瘤的进展中发挥重要作用。

图1 miR-144-3p在不同组织中的表达情况

Fig 1 miR-144-3p was differentially expressed in normal tissues and glioma tissues

aP<0.001,vstumor group;bP<0.001,vsadjacent group;cP<0.001,vstumor group.

图2 miR-144-3p在不同病理学分级胶质瘤中的表达

Fig 2 Expression levels of miR-144-3p in the different grades of glioma

aP<0.001,vsGrade Ⅳ;bP<0.001,vsGrade Ⅲ;cP<0.001,vsGrade Ⅳ;dP<0.05,vsGrade Ⅲ;eP<0.05,vsGrade Ⅳ.

图3 miR-144-3p在正常神经元和胶质瘤细胞系中的表达

Fig 3 Expressions of miR-144-3p in HCN-2, U251 and U87MG

aP<0.001,vsnormal tissue group;bP<0.001,vsnormal tissue group.

图4 miR-144-3p分子与胶质瘤患者术后生存期相关性

Fig 4 The levels of miR-144-3p were positively related to the survival days in patients with glioma

aP<0.001,vslow grade group.

讨 论

目前，在哺乳动物中现已被发现证实的miRNAs多达1 000条以上，其中多数为高度保守[1-3]。每一种miRNAs都有几个到几十个不同数量的下游靶基因，而同一个基因又往往受到不同的miRNAs的共同调控[1-4]。人类转录组中超过三分之一的转录本都会在不同时期受到miRNsA的转录后修饰。值得注意的是，从初始miRNAs的转录，到Drosha酶的切割形成前体miRNAs，再到Dicer酶的水解形成成熟miRNAs，每一个步骤都存在严密而精准的调控过程[2-8]。miRNAs和不同靶基因之间存在竞争性的调控关系，在不同组织、不同细胞以及不同状态下，由于其基因表达谱的差异，同一种miRNAs主要调控的靶基因不尽相同。正是由于miRNAs表达的精密调控和对靶基因的动态作用，使得miRNAs作为重要的表观遗传学调控因素，在诸如细胞增殖、细胞运动、定向发育、非对称性发育等多种细胞学行为中发挥调控作用[8-11]。

在本课题的研究中，我们发现，miR-144-3p与胶质瘤的发生发展相关，并随着其恶性分级的升高，表达逐步降低。在细胞系水平进行的体外实验也同样证实这一点。这些结果提示我们，miR-144-3p可能会参与胶质瘤的调控中，并且有可能作为早期诊断的分子预警标志、临床治疗的潜在靶点以及患者预后的参考标志。

在实验中，我们还发现miR-144-3p与miR-451a分子簇在染色质定位上彼此相距较近，仅相隔不到100 bp左右，很有可能拥有相同的转录调控机制。在基因组中，有的miRNAs位于编码蛋白的转录本内含子中，会跟随宿主基因的转录一同被转录，而后在转录后剪切的过程中，前体miRNAs被成功剪切出来。而有的miRNAs则位于不同基因之间的区域，这些miRNAs往往具有独立的启动子区域和调控序列[12-13]。很显然，miR-144-3p/miR-451a分子簇就属于后者。我们进一步的一系列实验均证实，miR-144-3p和miR-451a在不同样本之间的表达趋势均存在较好的一致性，且其两两之间表达水平也具有相关性。因此，很有可能miR-144-3p/miR-451a拥有共同的初始转录本，由于研究时间和深入程度有限，在本课题中未能解决该问题。然而这个问题却具有很强的临床意义，miR-144-3p在胶质瘤中表达降低的机制未明，极有可能是上游调控该分子簇的转录因子表达变化或者活性改变所致。因此，进一步研究miR-144-3p的转录起始位点对于阐明miR-144-3p在胶质瘤中的作用贡献、调控机制以及进一步的靶向治疗显得同样重要，这也是该课题下一步的方向之一。

参考文献

1MODREK A S, BAYIN N S, PLACANTONAKIS D G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma [J]. World J Stem Cells, 2014, 6(1): 43-52.

2LOUIS D N, OHGAKI H, WIESTLER O D, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system [J]. Acta Neuropathol, 2007, 114(2): 97-109.

3CAHILL D P, SLOAN A E, NAHED B V, et al. The role of neuropathology in the management of patients with diffuse low grade glioma: a systematic review and evidence-based clinical practice guideline [J]. J Neurooncol, 2015, 125(3): 531-549.

4COONS S W, JOHNSON P C, SCHEITHAUER B W, et al. Improving diagnostic accuracy and interobserver concordance in the classification and grading of primary gliomas [J]. Cancer, 1997, 79(7): 1381-1393.

5HEGI M E, DISERENS A C, GORLIA T, et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma [J]. N Engl J Med, 2005, 352(10): 997-1003.

6ZHANG J, STEVENS M F, BRADSHAW T D. Temozolomide: mechanisms of action, repair and resistance [J]. Curr Mol Pharmacol, 2012, 5(1): 102-114.

7ESTELLER M, GARCIA-FONCILAS J, ANDION E, et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents [J]. N Engl J Med, 2000, 343(19): 1350-1354.

8STUPP R, HEGI M E, MASON W P, et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial [J]. Lancet Oncol, 2009, 10(5): 459-466.

9CAIMCROSS J G, UEKI K, ZLATESCU M C, et al. Specific genetic predictors of chemotherapeutic response and survival in patients with anaplastic oligodendrogliomas [J]. J Natl Cancer Inst, 1998, 90(19): 1473-1479.

10YAN H, PARSONS D W, JIN G, et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas [J]. N Engl J Med, 2009, 360(8): 765-773.

11郭东生, 王宝峰, 毛峰, 等. LRLG基因家族在胶质瘤中的研究进展 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2015, 14(5): 475-477.

12Cancer Genome Atlas Research Network, BRAT D J, VERHAAK R G, et al. Comprehensive, integrative genomic analysis of diffuse lower-grade gliomas [J]. N Engl J Med, 2015, 372(26): 2481-2498.

13YANG H, YE D, GUAN K L, et al. IDH1 and IDH2 mutations in tumorigenesis: mechanistic insights and clinical perspectives [J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(20): 5562-5571.