贾婷婷，吴 哲，玉 柱

(中国农业大学动物科技学院，北京 100193)

燕麦(Avenasativa)是一种营养价值丰富的一年生禾谷类作物，在食品加工和饲料生产中都发挥着重要作用[1]。通过青贮的方式贮藏饲料作物，能够有效保存作物原料的营养成分。在不使用添加剂的情况下，原料上附着微生物在发酵过程中起主导作用，往往引起青贮饲料的干物质损失及蛋白质水解[2]。因此，添加剂特别是乳酸菌制剂常作为青贮发酵促进剂添加到青贮饲料中，乳酸菌添加剂能够增加青贮早期乳酸菌数量，快速生成乳酸降低青贮饲料的pH，改善青贮发酵品质。全株玉米(Zeamays)青贮中添加乳酸菌制剂可明显降低玉米青贮饲料的pH、氨态氮和丁酸含量，提高乳酸和总酸含量[3]；乳酸菌接种剂可以降低苜蓿(Medicagosativa)青贮饲料的pH，改善青贮发酵品质[4-5]。有关燕麦青贮的研究集中于燕麦不同生育时期及不同燕麦品种间青贮品质的差异[6]，不同含水量、切断长度、贮藏时间和贮藏方式对燕麦青贮饲料的影响[7-10]，及添加玉米粉、尿素和复合乳酸菌制剂对燕麦青贮品质的影响[7]。而有关不同类型乳酸菌制剂对燕麦青贮品质特别是有氧稳定性的影响尚未见报道。

燕麦青贮饲料使用不同的乳酸菌添加剂，其青贮品质和有氧稳定性可能存在差异。因此，本研究在燕麦青贮中添加植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，LP)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus，LR)和布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri，LB)，研究这3种乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料发酵品质、营养成分和有氧稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点位于内蒙古自治区中部的阿鲁科尔沁旗，地理坐标为43°21′43″-45°24′20″ N，119°02′15″-121°01′00″ E，海拔约430 m，年平均温度5.5 ℃左右，年均日照时数2 760～3 030 h，年均积温2 900～3 400 ℃·d，极端最高气温40.6 ℃，极端最低气温-32.7 ℃，年均降水量为300～400 mm，无霜期95～140 d，属温带大陆性气候。

1.2 试验设计

青贮燕麦原料品种为坝莜1号，种植于内蒙古自治区阿鲁科尔沁旗，2017年7月底播种，灌浆期收割后萎蔫3 h，用切碎机切至2 cm左右，将切碎混匀的燕麦原料，分别添加植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌(均由中国农业大学动物科技学院青贮实验室筛选研制)，并设置不添加菌剂的对照组(CK)，菌液按每克鲜草1×106cfu添加，对照添加等量蒸馏水，充分混合均匀后装入1 L青贮罐，装填密度为750 kg·m-3。每处理设置3个重复，于室温(20～30 ℃)下贮藏45 d。另取3份原料样品，于65 ℃下烘干至恒重，粉碎过0.425 mm筛后保存备用。

1.3 测定方法

1.3.1发酵品质测定 发酵45 d后，开启燕麦青贮罐，取20 g燕麦青贮饲料，加入180 mL蒸馏水后用组织捣碎机搅碎1 min。然后先用4层纱布滤去大部分草渣，再用定性滤纸过滤，得到的浸出液用来测定pH、有机酸和氨态氮含量。pH采用pH计(Five Easy plus, FE28)测定。用SHIMADZE-10A型高效液相色谱分别测定燕麦青贮饲料的乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)含量，色谱柱为Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column 30 mm×8 mm，柱温50 ℃，检测器为SPD-M10AVP，流动相为3 mmol·L-1高氯酸，检测波长210 nm，进样量5 μL[11]。氨态氮采用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定[12]。

1.3.2微生物组成测定 取燕麦青贮饲料鲜样20 g，加入180 mL灭菌的生理盐水，从10-1连续梯度稀释到10-7，测定燕麦青贮饲料中的乳酸菌、酵母菌、霉菌和肠细菌数量，乳酸菌和肠细菌分别采用MRS和伊红美蓝固体培养基进行计数，37 ℃厌氧培养2 d，酵母菌和霉菌采用孟加拉红培养基，在28 ℃下培养3～5 d后计数[13]。

1.3.3营养成分测定 燕麦青贮罐开启后随机取青贮饲料样品，65 ℃烘48 h，后粉碎过0.425 mm筛后保存于自封袋中。然后测定燕麦原料和青贮料的干物质(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)和淀粉(starch)含量。燕麦原料和青贮样的CP含量采用杨胜[14]的方法测定，用蒽酮-硫酸比色法测WSC和淀粉含量[15-16]，用范式洗涤纤维法测定NDF和ADF含量[17]。

1.3.4有氧稳定性测定 青贮饲料开启后，将剩余青贮饲料约500 g混匀后置入1 L聚乙烯罐中，插入温度记录仪(SMOWO MDL-1048A)探头，测定青贮饲料温度和环境温度，用青贮饲料温度与环境温度相差2 ℃时需要的时间来评定青贮饲料的有氧稳定性[18]。在有氧暴露时间为1、3、5、7 d时，取20 g青贮饲料测定pH，另取20 g测定有氧暴露过程中酵母菌数量的变化。

1.4 统计分析

用Excel 2010对数据进行整理，用SPSS 20.0统计软件中的Duncan’s多重比较法对不同乳酸菌添加剂处理间的差异性进行比较分析。

2 结果

2.1 燕麦原料的营养成分及其表面附着微生物组成

青贮发酵前燕麦干物质含量为35.83%，粗蛋白含量为12.41%，可溶性碳水化合物含量为7.79%，乳酸菌数目接近5 lg cfu·g-1，肠细菌数目大于5 lg cfu·g-1(表1)。

2.2 乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料发酵品质的影响

乳酸菌添加剂显著影响营养燕麦青贮饲料的发酵品质(P<0.05)(表2)。与对照组相比，处理组pH显著降低，其中添加鼠李糖乳杆菌处理的燕麦青贮饲料pH在所有处理中最低(P<0.05)；3种乳酸菌添加剂处理的燕麦青贮饲料LA含量显著高于对照(P<0.05)，AA含量以添加布氏乳杆菌的处理最高，PA含量对照组显著高于添加乳酸菌处理(P<0.05)；添加乳酸菌处理的NH3-N∶总氮含量显著低于对照(P<0.05)；LA∶AA值以添加布氏乳杆菌的处理最低，显著低于添加鼠李糖乳杆菌的处理(P<0.05)。

2.3 乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料微生物组成的影响

乳酸菌添加剂显著影响燕麦青贮饲料的微生物组成(P<0.05)(表3)。乳酸菌数量以添加植物乳杆菌的处理最高，显著高于对照及其他处理(P<0.05)；对照和添加布氏乳杆菌处理均未检测到酵母菌，添加植物乳杆菌处理的酵母菌数量显著高于添加鼠李糖乳杆菌处理的酵母菌数量(P<0.05)；对照及其他处理均未检测到霉菌；肠细菌数量以添加植物乳杆菌的处理最高，显著高于对照和其他处理(P<0.05)。

表1 燕麦原料的营养成分及其表面附着微生物组成Table 1 The nutrient and microbial composition of Avena sativa before ensiling

ND代表未检测到，下同。CP、NDF、ADF、HC、WSC和Starch含量计算以干物质为基础。

ND represent no detected; CP, NDF, ADF, HC, WSC, and Starch were calculated based on dry matter; similarly for the following tables.

2.4 乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料营养成分的影响

乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料的干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和淀粉含量均没有显著影响(表4)，对燕麦青贮饲料的可溶性碳水化合物含量影响显著，具体表现为植物乳杆菌和布氏乳杆菌处理组的可溶性碳水化合物含量显著高于对照和鼠李糖乳杆菌处理组(P<0.05)。

2.5 乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料有氧稳定性的影响

乳酸菌添加剂明显影响燕麦青贮饲料的有氧稳定性(图1)。对照和添加布氏乳杆菌处理的有氧稳定时间超过168 h，显著高于添加植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的处理(P<0.05)。随有氧暴露天数的增加，对照和添加布氏乳杆菌处理的pH变化平稳，基本维持在4.0左右，添加植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌处理的pH在前3 d较稳定，至5 d开始，pH上升至7以上。随有氧暴露天数的增加，酵母菌的数量总体呈逐渐上升的趋势，其中添加植物乳杆菌处理的酵母菌数量始终高于其他处理，且其酵母菌数量在3 d时迅速上升，酵母菌数量较低的为对照和添加布氏乳杆菌的处理。

同行不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，CK，未添加乳酸菌对照组；ND,未检测到；下表同。所有指标计算以干物质为基础。

Values in same line with different lowercase letters show significant differences among treatments at the 0.05 level; CK, no addition; LP,Lactobacillusplantarum; LR,Lactobacillusrhamnous; LB,Lactobacillusbuchneri; ND, undetected; similarly for the Table 3 and Table 4. All the parameters were calculated based on dry matter.

表3 乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料微生物组成的影响Table 3 Effect of Lactobacillus inoculants on microbial composition of Avena sativa silages

所有指标计算以鲜重为基础。

All the parameters were calculated based on fresh weight.

表4 乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料营养成分的影响Table 4 Effect of Lactobacillus inoculants on nutrient composition of Avena sativa silages

所有指标计算以干物质为基础。

All the parameters were calculated based on dry matter.

图1 乳酸菌添加剂对燕麦青贮饲料有氧稳定性的影响Fig. 1 Effect of lactobacillus inoculants on aerobic stability of Avena sativa silages

CK，无添加对照组；LP，植物乳杆菌；LR，鼠李糖乳杆菌；LB，布氏乳杆菌。不同小写字母表示不同添加剂间差异显著(P<0.05)。

CK, no addition; LP,Lactobacillusplantarum; LR,Lactobacillusrhamnous; LB,Lactobacillusbuchneri. Different lowercase letters indicate significant difference among different addition treatments at the 0.05 level.

3 讨论

经45 d发酵，燕麦青贮饲料的pH值均降至4.2以下，达优等质量,这可能与燕麦青贮原料表面附着乳酸菌数量足够且发酵底物充足有关。对燕麦青贮饲料分别添加植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌后，pH下降明显，显著低于对照，说明乳酸菌添加剂能够有效地降低燕麦青贮饲料的pH，改善发酵品质。这与前人有关乳酸菌处理组的pH显著低于无添加剂处理组的研究结果相似[5,19]，植物乳杆菌降低了青贮料的pH[20-22]。此外，pH是青贮过程中酸类物质特别是乳酸积累情况的反映[23]，本研究中,添加3种乳酸菌明显促进了燕麦青贮饲料中乳酸的生成，且添加布氏乳杆菌明显的增加了乙酸含量，降低了乳酸∶乙酸的比值，因布氏乳杆菌是异型乳酸菌，除代谢产生大量乳酸外，还产生较多乙酸[24]。添加3种乳酸菌后，燕麦青贮饲料中的丙酸含量明显低于对照，各处理均未检测到丁酸，这可能是因为燕麦青贮饲料pH的降低，酸类物质的积累抑制了有害微生物梭菌，因丁酸是梭菌等有害微生物分解青贮料中糖分所产生的。氨态氮含量是青贮饲料中蛋白质及氨基酸分解程度的反映，本研究中添加3种乳酸菌均显著降低了燕麦青贮饲料中的氨态氮浓度，这说明添加3种乳酸菌能明显的抑制燕麦青贮饲料蛋白质的分解，因pH影响青贮饲料中蛋白分解酶的活性，且在低pH下植物蛋白酶的活性受到抑制，燕麦青贮饲料中3种乳酸菌制剂的使用降低了青贮料的pH，抑制了蛋白质的分解，减少了氨态氮的含量[2]。

添加3种乳酸菌对燕麦青贮饲料的干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、半纤维素和淀粉含量影响不大，但显著影响了燕麦青贮饲料的可溶性碳水化合物。青贮过程中，可溶性糖是乳酸菌发酵的物质基础，是青贮过程中的主要来源，本研究中植物乳杆菌和布氏乳杆菌处理组保留的WSC含量较高，这可能是因为乳酸菌添加能在发酵初期迅速降低青贮饲料的pH，从而减少不良微生物对WSC的消耗。

青贮饲料暴露于空气中后，打破了青贮体系中的厌氧状态，好氧微生物如酵母菌等开始活跃。青贮饲料的腐败变质一般因酵母菌增殖而引起，随酵母菌消耗乳酸，饲料的pH升高，霉菌逐渐恢复活性，最后导致饲料腐败变质。当青贮饲料中酵母菌数目高于5 lg cfu·g-1时，青贮饲料易发生腐败变质[23]。本研究中在植物乳杆菌处理组，酵母菌数量高于5 lg cfu·g-1，饲料中含有大量的乳酸，其暴露在空气中温差上升2 ℃的时间在所有处理中最短，随有氧暴露时间的延长，其pH和酵母菌数量迅速上升，因植物乳杆菌为同型发酵乳酸菌，其主要发酵产生乳酸，而乳酸抗真菌能力不强[25]，因此有氧稳定性差，燕麦青贮饲料发生腐败。而布氏乳杆菌为异型发酵乳酸菌，能将青贮过程中产生的乳酸分解为乙酸，乙酸具有较强的真菌抑制能力[26-27]，因此,添加布氏乳杆菌的燕麦青贮饲料有氧稳定性较好；然而，值得注意的是,对照组的有氧稳定时间也超过168 h，这可能是因为对照组有最高的丙酸和较高的乙酸含量，丙酸和乙酸有利于改善青贮饲料的二次发酵[28]，也可能是因为附着于牧草表面的乳酸菌主要为异型发酵菌[29]。

4 结论

添加3种乳酸菌添加剂均能显著改善燕麦青贮饲料的发酵品质；添加植物乳杆菌和布氏乳杆菌能保留较多的燕麦青贮饲料WSC含量；对照组和添加布氏乳杆菌处理的有氧稳定性较优。

参考文献References：

[1] 任长忠,胡跃高.中国燕麦学.北京:中国农业出版社,2013.

Ren C Z,Hu Y G.Chinese Oat Study.Beijing:Beijing Agricultural University Press,2013.(in Chinese)

[2] McDonld P,Henderson A R,Heron S J E.The Biochemistry of Silage.Welton,Lincoln,UK:Chalcombe Publications,1991.

[3] 樊振,马贵军,姚峻,刘建成,马燕,蒋粒薪.不同发酵类型乳酸菌对玉米青贮发酵品质的影响.饲料研究,2014(1):43-45.

Fan Z,Ma G J,Yao J,Liu J C,Ma Y,Jiang L X.The effect of different types of lactic acid bacteria on corn silage.Feed Research,2014(1):43-45.(in Chinese)

[4] Fllva I,Muck R E,Contreras Govea F E.lnoculant effects on alfalfa silage:Fermentation products and nutritive value.Journal of Dairy Science,2007,90(11):5108-5114.

[5] 侯建建,白春生,张庆,玉柱.单一和复合乳酸菌添加水平对苜蓿青贮营养品质及蛋白组分的影响.草业科学,2016,33(10):2119-2125.

Hou J J,Bai C S,Zhang Q,Yu Z.Effects of different additive amount of single and multiple lactic acid bacteria on the silage quality and protein fractions of alfalfa.Pratacultural Science,2016,33(10):2119-2125.(in Chinese)

[6] 杨云贵,程天亮,杨雪娇,张越利.3个燕麦品种不同收获期对青贮饲草营养价值的影响.草地学报,2013,21(4):683-688.

Yang Y G,Cheng T L,Yang X J,Zhang Y L.Effects of different growth stages of three oat cultivars on the nutritive value of silage.Acta Agrestia Sinica,2013,21(4):683-688.(in Chinese)

[7] 覃方锉,赵桂琴,焦婷,韩永杰,侯建杰,宋旭东.含水量及添加剂对燕麦捆裹青贮品质的影响.草业学报,2014,23(6):119-125.

Qin F C,Zhao G Q,Jiao T,Han Y J,Hou J J,Song X D.Effects of different moisture contents and additives on the quality of bales oat silage.Acta Prataculturae Sinica,2014,23(6):119-125.(in Chinese)

[8] Bhandari S K,Li S,Ominski K H,Wittenberg K M,Plaizier J C.Effects of the chop lengths of alfalfa silage and oat silage on feed intake,milk production,feeding behavior,and rumen fermentation of dairy cows.Journal of Dairy Science,2008,91(5):1942-1958.

[9] Mustafa A F,Seguin P.Effects of stage of maturity on ensiling characteristics and ruminal nutrient degradability of oat silage.Archives of Animal Nutrition,2003,57(5):347-357.

[10] Romero J J,Zhao Y,Balseca-Paredes M A,Tiezzi F,Gutierrez-Rodriguez E,Castillo M S.Laboratory silo type and inoculation effects on nutritional composition,fermentation,and bacterial and fungal communities of oat silage.Journal of Dairy Science,2017,100(3):1812-1828.

[11] 许庆方,玉柱,韩建国,白春生,薛艳林,荀桂荣.高效液相色谱法测定紫花苜蓿青贮中的有机酸.草原与草坪,2007(2):63-65.

Xu Q F,Yu Z,Han J G,Bai C S,Xue Y L,Xun G R.Determing organic acid in alfalfa silageby HPLC.Grassland and Turf,2007(2):63-65.(in Chinese)

[12] Broderick G A,Kang J H.Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media.Journal of Dairy Science,1980,63(1):64-75.

[13] Zhang Q,Li X J,Zhao M M,Yu Z.Isolating and evaluating lactic acid bacteria strains for effectiveness ofLeymuschinensissilage fermentation.Letters in Applied Microbiology,2014,59(4):391-397.

[14] 杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术.北京:北京农业大学出版社,1999:58-63.

Yang S.Feed Analysis and Feed Quality Detection Technology.Beijing:Beijing Agricultural University Press,1999:58-63.(in Chinese)

[15] Murphy R P.A method for the extraction of plant samples and the determination of total soluble carbohydrates.Journal of the Science of Food and Agriculture,1958,9:714-717.

[16] Hall M B.Determination of starch,including maltooligosaccharides,in animal feeds:Comparison of methods and a method recommended for AOAC collaborative study.Journal of AOAC International 2008,92:42-49.

[17] van Soest P J,Robertson J B,Lewis B A.Methods for dietary fiber,neutral detergent fiber,and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition.Journal of Dairy Science，1991,74:3583-3597.

[18] Ranjit N K,Kung L J.The effect ofLactobacillusbuchneri,Lactobacillusplantarum,or a chemical preservative on the fermentation and aerobic stability of corn silage.Journal of Dairy Science,2000,83:526-35.

[19] 云颖,赵苗苗,双胡尔,吴哲,玉柱.刈割期和添加剂对苜蓿青贮发酵品质和CNCPS蛋白组分的影响.草业科学,2017,34(10):2149-2156.

Yun Y,Zhao M M,Shuang H E,Wu Z,Yu Z.Effect of mowing period and additives on fermentation quality and CNCPS protein components of alfalfa silage.Pratacultural Science,2017,34(10):2149-2156.(in Chinese)

[20] 韩立英,玉柱,周禾.乳酸菌和纤维素酶对直穗鹅观草青贮的改善效果.草业科学,2013,30(9):1439-1444.

Han L Y,Yu Z,Zhou H.Effects of lactic acid bacteria inoculants and enzymes onRoegneriaturczaninoviisilages.Pratacultural Science,2013,30(9):1439-1444.(in Chinese)

[21] 关皓,张明均,宋珊,郭旭生,干友民.添加剂对不同干物质含量的多花黑麦草青贮品质的影响.草业科学,2017,34(10):2157-2163.

Guan H,Zhang M J,Song S,Guo X S,Gan Y M.Effect of additives on the quality of rye grass silage with different dry matter content.Pratacultural Science,2017,34(10):2157-2163.(in Chinese)

[22] Hristov A N,McAllister T A.Effect of inoculants on whole-crop baley silage fermentation and dry matter disappearance in situ.Journal of Animal Science,2002,80(2):510-516.

[23] Buxton D R,Muck R E,Harrison J H.Silage Science and Technology.Madison,WI,USA:ASA Inc,2003:305-359.

[24] Filya I,Sucu E,Karabulut A.The effect ofLactobacillusbuchnerion the fermentation,aerobic stability and ruminal degradability of maize silage.Journal of Applied Microbiology,2006,101(6):1216-1223.

[25] Muck R E,Kung L Jr.Effects of silage additives on ensiling in silage:Field to feedbunk NRAES-99.Ithaca,N.Y:Northeast Eegional Agricultural Engineering Service,1997:187-199.

[26] Courtin M G,Spoelstra S F.A simulation model of the microbiological and chemical changes accompanying the initial stage of aerobic deterioration of silage.Grass and Forage Science,1990,45:153-165.

[27] Kung L Jr,Ranjit N K.The effect ofLactobacillusbuchneriand other additives on the fermentation and aerobic stability of barley silage.Journal of Dairy Science,2001,84:1149-1155.

[28] Huber J T,Scejono M.Organic acid treatment of high dry matter corn silage fed lactating dairy cows.Journal of Dairy Science,1976,59:2063-2070.

[29] Cai Y,Ohmomo S,Kumai S.Distribution and lactate fermentation characteristics of lactic acid bacteria on forage crops and grasses.Journal of Japanese Society of Grassland Science,1994,39:420-428.