罗涵夫，齐 晓，麦靖雯，张巨明

(1.华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642； 2.广东省草业工程技术研究中心，广东 广州 510642；3.全国畜牧总站全国草品种审定委员会办公室，北京100125)

在知识和经济全球化迅猛发展的大背景下，我国农产品在质量、价格和知识产权保护等方面面临着全球化带来的激烈竞争。因此建立以知识产权保护为基础的植物新品种保护体系，对提高我国农产品国际竞争力有着重要作用[1]。截至2016年4月，农业部已公布了9批、93种植物新品种保护名录，授予新品种权7 443个，有效品种权5 209件；国家林业局已公布5批、198种植物新品种保护名录，授予新品种权913个[2]。我国新品种保护工作取得了巨大的进展。

对植物新品种的特异性(distinctness)、一致性(uniformity)和稳定性(stability)测试，简称DUS测试，由国际植物新品种保护联盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants,UPOV)提出，其是植物新品种保护的技术基础和授权依据[3]。美国、欧洲和日本等国家研究较早，我国直到1998年才开始DUS测试研究及测试工作[4]。1997年10月1日，我国颁布《植物新品种保护条例》，规定品种授权必须具有新颖性、特异性、一致性和稳定性。开展新品种保护的技术条件是建立新品种特异性、一致性和稳定性的测试体系。截至2015年，我国共开展366个测试指南的研制工作,已完成了186种植物的DUS测试指南研制，发布了16种植物DNA指纹图谱鉴定方法[5]。而UPOV已经开展了592个测试指南的研制工作，颁布了281个种属(2013年)的测试指南；日本也开展了500多个种属的指南研制工作[1]。

结缕草属(Zoysia)隶属于禾本科(Gramineae)，包括11个种和部分变种和变型，我国有5个种、2个变种、1个变型，其中5个种为结缕草(Z.japonica)、中华结缕草(Z.sinica)、大穗结缕草(Z.macrostachya)、沟叶结缕草(Z.matrella)和细叶结缕草(Z.tenuifolia)，2个变种为长花结缕草(Z.sinicavar.nipponica)和青结缕草(Z.japonicavar.pollida)，1个变型为大穗日本结缕草(Z.japonicaf.macrostachya)[6-7]。结缕草原产于我国，是我国重要的草坪草种质资源，其抗逆性强，耐磨，对水肥需求低，被公认为环境友好型草坪草，广泛应用于亚热带和温带地区。结缕草属植物于2014年被中国农业部列入第10批新品种保护名录，同年4月，农业部颁布实施《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南结缕草属》农业行业标准，这为我国结缕草品种保护工作奠定了基础。根据国家草品种区域试验的要求，从2016年开始对申报品种在区域试验的基础上还需进行DUS测试。但由于我国结缕草DUS测试指南2014年才颁布，还未见对结缕草新品种的测试报道。华南农业大学2016年接受了农业部2个结缕草申请品种的DUS测试任务，首次按结缕草属DUS测试指南，对结缕草进行了连续2个独立生长周期DUS测试，从12个数量性状中选取8个需要测量的数量性状进行分析，以期验证、优化结缕草DUS测试判定方法，为结缕草新品种DUS测试性状的判定提供更可靠充分的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料共10份(表1)，分别为不同的种、品种(系)，其中测试申请品种2个，分别为广绿结缕草(以下简称广绿)、Z0413-1杂交结缕草(以下简称Z0413-1)；对应的近似品种2个，分别为兰引Ⅲ号结缕草(以下简称兰引Ⅲ号)、Diamond结缕草(以下简称Diamond)；以及6个标准品种，分别为大穗结缕草、青岛结缕草、中华结缕草、沟叶结缕草、细叶结缕草和兰引Ⅱ号结缕草。供试材料均为营养茎。

1.2 试验设计

申请品种和近似品种相邻种植。种植分为单株种植(单株区)和密植种植(密植区)。单株区每个品种种植15株，株行距1.5 m；密植区小区面积1 m×2 m，株行距5 cm×15 cm，设置2个重复。

1.3 试验实施

试验地位于广东增城华南农业大学宁西实验基地，海拔约41 m，地形平坦，坡向西南，土壤类型为壤土，土壤有机质含量1.65%，速效N含量12.25 clamg·kg-1，速效P含量49.08 mg·kg-1，速效K含量142.02 mg·kg-1，土壤pH 6.61。试验时间为2016年7月10日到2017年9月30日，连续进行两个年度两个完整生长周期的测试。种植采用营养茎繁殖方式，取含2～3个茎节、长5～8 cm、生长一致的营养茎扦插。单株区每穴扦插3枝，深度3～5 cm，成活后保留1枝，用于观测；密植区按株行距扦插，深度3～5 cm。田间管理按常规管理措施，每月施肥一次，施用“挪威牌”复合肥(总养分45%；N、P、K养分比例各占15%)，施肥量为30 g·m-2；每周浇水1～2次；根据小区具体生长情况及时拔除杂草并开展病虫害防治；单株区不修剪，密植区修剪，生长季节每周修剪一次，剪草高度3～5 cm。

表1 结缕草DUS测试品种材料名称Table 1 Names of Zoysiagrass varieties for DUS testing

1.4 测定指标及方法

试验按照《中华人民共和国农业行业标准植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南结缕草属》[8]，从12个数量性状中剔除4个目测数量性状(即测试指南中观测方法为VG或VS),选取植株自然高度和匍匐茎节间长度等8个需要测量的数量性状(即测试指南中观测方法为MG或MS)。数量性状用直尺、游标卡尺和电子天平测量(表2)，并进行代码法分级和统计分析。

代码法是指对于某个特定的性状，依据种植试验中记录的品种表达状态进行特异性评价。测试指南中每一个数量性状都规定了不同的分级及相应代码和描述，测量标准品种，使用公式(1)计算得到数量性状分级的级差。

R=(Vi-Vj)/(Ci-Cj)。

(1)

式中：R为数量性状分级的级差，Vi、Vj为该性状标准品种测量均值，Ci、Cj为标准品种对应的代码。

分级范围的上下限通过公式(2)、(3)计算得到。

S上=(n-i+0.5)×R+Vi；

(2)

S下=(n-i-0.5)×R+Vi。

(3)

式中：S上、S下为代码n对应分级范围的上限和下限，i为标准品种对应的代码，R为级差，Vi为标准品种测量均值。

再测量申请品种，根据其所属的分级范围，最后确定其对应的代码及描述。申请品种与其近似品种代码和描述相同，则表示没有差异，反之表示有差异。

统计分析采用Excel 2010、SPSS 19.0统计分析软件进行处理及两个独立样本的t检验，在0.05水平下进行比较。

2 结果与分析

2.1 数量性状测试结果

从2016年7月到2017年9月，对结缕草测试材料8个数量性状连续两个生长季做DUS测试，结果表明，无论是标准品种，还是测试种或近似种，年度间性状表现差异很大(表3)。

2.2 代码法分析

在2016年至2017年连续两年测试中，通过测量测试指南规定的标准品种，分别计算得到2016年和2017年8个数量性状的不同代码所对应的分级范围(表4、表5)。

表2 结缕草DUS测试数量性状及观测方法Table 2 Quantitative characteristics and methods for zoysiagrass DUS testing

MG，群体测量； MS，个体测量； PNH，植株自然高度；SLOI，匍匐茎节间长；SD,匍匐茎直径；LL,叶长；LW,叶宽；IL,花序长度；INOS,花序小穗数；KGW,千粒重。下同。

MG, measurement of a group of plants or parts of plants; MS, measurement of a number of individual plants or parts of plants; PNH, plant natural height; SLOI, stolon length of internode; SD, stolon diameter; LL, leaf length; LW, leaf width; IL, inflorescence length; INOS, Inflorescence numbers of spikelet; KGW, kilo grain weight. similarly for the following tables.

表3 结缕草DUS测试数量性状测试结果Table 3 Results of quantitative characteristics measurement of zoysiagrass DUS testing

标准品种i和标准品种j为测试指南所选定的对应性状的2个标准品种。

Standard varietyiand standard varietyjare two standard varieties for corresponding characteristics.

根据表4和表5测定分级范围及代码，分别对表3测定结果进行特异性判别，得到2016年和2017年两个测试种的特异性判别结果(表6)。2016年度申请品种广绿与其近似品种有5个性状有差异，其中匍匐茎节间长、叶长、种子千粒重3个性状的差异大于1个级差；而申请品种Z0413-1与其近似品种有3个有差异的性状，分别为匍匐茎节间长、叶宽、花序小穗数，但3个有差异的性状级差均为1(表6)。2017年度申请品种广绿与其近似品种仅有4个有差异的性状。2016年与2017年相比，性状匍匐茎节间长，叶长，叶宽3个性状在两年独立的测试中均表现为有差异，而株高、花序长和种子千粒重3个性状仅在一年中表现出差异；申请品种Z0413-1与其近似品种在匍匐茎节间长和花序小穗数2个性状在两年独立的测试中均表现为有差异，而性状株高和叶宽仅在一年中有差异。

表4 2016年测试数量性状分级范围及代码Table 4 Scales and notes of quantitative characteristics in 2016

表5 2017年测试数量性状分级范围及代码Table 5 Scales and notes of quantitative characteristics in 2017

2.3 数理统计分析

对数量性状测定结果进行t检验(表7)。统计结果显示，2016年度申请品种广绿与其近似品种在匍匐茎节间长、叶宽、叶长、花序长和种子千粒重5个性状上有显著差异差异(P<0.05)；2017年度广绿匍匐茎节间长、叶长和种子千粒重3个性状上存在显著差异(P<0.05)。

2016年度申请品种Z0413-1与其近似品种在匍匐茎节间长、叶宽、花序长、花序小穗数和种子千粒重5个性状上存在显著差异(P<0.05)。2017年度的测试中，在株高、匍匐茎节间长、叶片长、叶宽、花序长度、花序小穗数和种子千粒重7个性状上存在显著差异(P<0.05)。

2.4 代码法和数理统计法分析结果对比

代码法和数理判别结果不尽相同(表8)。代码法判定有特异性的数量性状不一定在统计学上有显著差异，而判定为没有特异性的数量性状在统计学上却有显著差异。

表6 数量性状代码法判别结果Table 6 Results ofquantitative characteristicswith the note method

Y，具备特异性；N，不具备特异性。下同。

Y, With distinctness; N, without distinctness; similarly for the following tables.

从对比结果可以看出，2016年度申请品种广绿与其近似品种的统计结果与“代码”法判别结果完全相同，而2017年度的测试在株高和叶宽上两种方法判定有差异。2016年度申请品种Z0413-1与其近似品种的统计结果和代码法判别结果基本一致，在花序长和种子千粒重上两种方法判定有差异。而2017年度的测试中在叶长、叶宽、花序长和种子千粒重4个性状上，代码法判定没有特异性，而t检验结果显示差异显著(P<0.05)。

3 讨论与结论

数量性状是以一维的、线性等级进行描述的性状，这种一维、线性和连续变化的特性决定了该性状不能单纯依靠性状所处的分级范围相同与否来判断申请品种与其近似品种特异性有无[9]。本研究结果证明了这一点：部分处于相邻分级范围的数量性状，实际上并没有显著性差异，如广绿的叶宽，株高等就属于这种情况。2017年度申请品种广绿叶片宽度(3.84 mm)与其近似品种兰引Ⅲ号叶片宽度(4.28 mm)之间无显著差异(P<0.05)，却落入了分级边界(3.9 mm)左右，被赋予了‘6’和‘7’两个不同的描述代码。为了避免两个品种都非常接近同一分级值(如代码6的上端和代码7的下端)导致的代码法和数理统计法判定出现差异，陈海荣和顾晓君[10]认为，在符合一致性和稳定性要求的情况下，若申请品种与其近似品种的性状取值的平均数分别处于非相邻的分级范围，或者处于相邻分级范围，但两者之间的差值大于该性状的级差时，则认定两者存在明显差异，说明申请品种具备特异性；若申请品种与其近似品种的性状取值的平均数处于相邻的分级范围，且两者之间的差值小于或等于该性状的级差时，即可认定申请品种与其近似品种间不存在显著差异，说明申请品种不具备特异性。但这也不是判定特异性的绝对标准。随着育种技术的日新月异，新品种之间的差异较测试指南制定时，品种间的差异更加精细，而且受品种测试地点、年份、环境差异或表达程度等因素的影响[11]。

为确保数量性状特异性判别结果的科学性和客观性，本研究在代码法判别的基础上，进一步进行了数理统计分析，对特异性进行综合判定。数量性状特异性判定既要符合DUS测试特异性判别要求，又要同时满足统计学上差异显著性要求，可分3种情形判定。第一，如果某一数量性状在2个年度的测试中2种判定方法均判定为有差异，则可认为申请品种在该性状上具备特异性，如广绿结缕草测试中的性状匍匐茎节间长、叶长和Z0413-1结缕草测试中的性状匍匐茎节间长、花序小穗数；第二，如果某一数量性状在2个年度的测试中数理统计分析均有差异且仅有其中1个年度的代码法判定没有差异，也可认为申请品种在该性状上具备特异性，因为这极有可能是两个品种该年度的测量值很接近同一分级边界值导致代码法判定没有差异，只能通过数理统计方法进行判定，如广绿结缕草测试中的种子千粒重和Z0413-1结缕草测试中的叶宽；第三，其他情况，如代码法判别连续2个年度均没有特异性，统计法连续2个年度均没有显著差异，代码法判别有1个年度有特异性但统计法连续2个年度均没有显著差异等，均不能判定申请品种在该性状上具备特异性。根据以上判别原则，本研究申请品种广绿结缕草与其近似品种兰引Ⅲ号结缕草相比，在匍匐茎节间长、叶长和种子千粒重3个数量性状上具备特异性；申请品种Z0413-1结缕草与其近似品种Diamond结缕草相比，在匍匐茎节间长、花序小穗数和叶宽3个数量性状上具备特异性。

表7 数量性状t检验结果Table 7 T-test result of quantitative characteristics

数据后“*”表示申请品种与近似品种该性状在0.05水平上有显著差异。

Value with ‘*’ indicate significant differences among candidate variety and selecting variety at the 0.05 level.

表8 测量性状t检验和代码法结果对比Table 8 Quantitative characteristics comparison between t-test result and note assessment

国外的DUS测试起步早，特异性判别方法较为专业、系统和先进。针对植物新品种DUS测试自身特性，UPOV有关专家研制出了一种跨年度综合特异性的方法(Combined Over-Years Distinctness Criterion,COYD)。该方法考虑到了年度间的变异，主要用于异花授粉品种，也可以用于自花授粉和无性繁殖品种。除此之外，还开发了数据库自动筛选程序(GAIA法)，该程序可以完成不同品种(尤其是成对材料)间数量性状、质量性状和电泳测试性状的分析比较，对于申请品种和近似品种过于相近的情况具有较好的辨别和分析能力[12]。除了传统的DUS测试，DNA分子标记技术已经广泛地用于植物新品种鉴定和检测试验中。李汝玉等[13]认为，SSR标记是植物品种特异性鉴定的最好方法。已成功运用于油菜(Brassicanapus)[14]、小麦(Triticumaestivum)[15]、大麦(Hordeumvulgare)[16]和西瓜(Citrulluslanatus)[17]等多种作物的DUS测试。目前，我国玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)品种鉴定的指纹方法已经成为国家标准[1]。草品种中的柱花草(Stylosanthesspp．)[18]、牛鞭草(Hemarthriaaltissima)[19]和苜蓿(Medicagosativa)[20]也已经完成了DNA指纹图谱的构建。我国DUS测试研究及实施较晚，还没有COYD等测试方法的报道，今后除了完善符合国情的DUS测试体系，加快DNA指纹图谱的构建，还要借鉴国外成熟的经验，尽早开展COYD研究工作，并开发我国自己的GAIA程序，这应该是我国DUS测试的研究方向。

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