李文丽 余 鹃 向军俭 王 宏

(暨南大学生命科学技术学院生物工程学系,广州 510632)

《中国心血管病报告2016》报告，占城乡居民总死亡原因首位的是心血管病，其中农村为45.01%，城市为42.61%。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是冠心病的一种类型，随着我国社会发展，饮食结构的改变，生活节奏加快，急性心肌梗死已经呈现逐年上升的趋势，发病越来越年轻化，并且男性发生的概率高于女性[1]。

现代医学上检测急性心肌梗死有三个标准，缺血性胸痛病史、心电图特征性改变和血清中心肌标志物浓度的变化[2]。由于心肌肌钙蛋白I(human cardiac troponin I ，cTnⅠ)在心肌受损时才在血液中出现，并且出现时间早，持续时间久，特异性强(持续时间>96 h)，因此国际临床化学联盟(IFCC)、美国临床生化学会(NACB)和中华医学检验分会等权威机构已将cTnⅠ作为AMI诊断的“金标准”[3，4]。

心肌肌钙蛋白Ⅰ、心肌肌钙蛋白T和心肌肌钙蛋白C三者形成三聚体复合物[5]。研究发现，当心肌发生损伤，外周血中90%的cTnⅠ以cTnⅠ-C或cTnⅠ-T-C复合物存在，单体形式存在较少[6]。因此建立能够检测以不同形式存在的cTnⅠ的检测方法是必要的。本研究在前期成功获得2株识别不同cTnⅠ表位的基础上，建立可以检测以cTnⅠ单体、cTnⅠ-C和cTnⅠ-T-C复合物形式存在的cTnⅠ的鲁米诺化学发光酶免疫分析法，具有更高的实用性。

1 材料与方法

1.1实验材料 人源的cTnⅠ-T-C抗原购自芬兰Hytest公司；雌性BALB/c小鼠：6周龄，清洁级，购自南方医科大学实验动物中心；cTnⅠ、cTnⅠ-C本实验室表达；弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培养基购自Gibco；HRP标记羊抗鼠IgG二抗购自KPL公司；HRP标记试剂盒(A型)购自北京泰天河生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Fisher公司；患者血浆样本取自华侨医院检验科，其中阳性样本22例，阴性样本8例。

1.2实验方法

1.2.1细胞的复苏 从实验室液氮中取出分泌Ab1、Ab3的细胞株7D2和7H4，浸没于的37℃水中快速摇晃，待冻存管中的细胞融化后，将细胞悬液加入装有10 ml左右RPMI1640无血清培养基的离心管中，1 000 r/min离心7 min，弃上清，加入适量含血清培养基，用移液枪重悬后置于培养皿中培养，置于37℃，5%CO2培养箱，4 h后换液。

1.2.2抗体亚型鉴定 采用SBA Clonotyping System-HRP试剂盒对Ab1和Ab3进行亚型鉴定。

1.2.3腹水型单克隆抗体的制备 采用小鼠体内诱生法来制备腹水型单抗。

1.2.4单克隆抗体的纯化 硫酸铵可以沉淀粗制品中的绝大部分蛋白，从而起到蛋白质的初步纯化作用。为此，常将硫酸铵沉淀法作为初步分离免疫球蛋白的粗纯手段[7]。饱和硫酸铵沉淀法粗纯之后用Protein G亲和层析柱进行纯化。

1.2.5单克隆抗体纯化效果的鉴定 纯化后的单克隆抗体经BCA蛋白浓度试剂盒测定其浓度，经SDS-PAGE法鉴定其蛋白纯度。

1.2.6间接ELISA法鉴定单克隆抗体特异性 碳酸盐包被液稀释人源的cTnⅠ-T-C、cTnⅠ和cTnⅠ-C抗原0.5 μg/ml，孵育之后PBS-T缓冲液洗涤3次，再用5%的脱脂奶粉封闭，PBS-T缓冲液洗涤3次。将纯化之后的单克隆抗体用PBS缓冲液从一定的倍数进行倍比稀释，孵育之后PBS-T缓冲液洗涤3次。将羊抗鼠IgG用PBS-T稀释至8 000倍，孵育之后PBS-T缓冲液洗涤5次，每孔加入TMB底物显色液，室温避光静置反应10 min后每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取OD450nm吸光度数值，分析数据。

1.2.7抗体亲和常数的测定 根据G.P.S.Raghava的方法，通过非竞争酶免疫实验做出的亲和力测定曲线，利用公式Ka =(n-1)/2(n[Ab']t-[Ab]t)计算亲和常数Ka值。

1.2.8建立检测人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)鲁米诺化学发光酶免疫分析方法 (1)捕获抗体浓度的选择 检测抗体浓度不变，将捕获抗体浓度和cTnⅠ-T-C抗原浓度梯度稀释，分析捕获抗体浓度对检测灵敏度的影响，选择最佳的捕获抗体浓度。用碳酸盐包被液稀释Ab3至2、1、0.5、0.25 μg/ml，每孔加100 μl，4℃过夜。加200 μl 5%脱脂奶粉封闭2 h。分别稀释cTnⅠ-T-C抗原至400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/ml 37℃孵育1 h。分别加入100 μl按照1∶1 000稀释的HRP-Ab1，孵育1 h。分别加入50 μl 鲁米诺A、B显色液，显色10 min。酶标仪读取吸光度数值ODLum，分析数据。

(2)检测抗体浓度的选择 以最适的抗体浓度包被化学发光酶标板，将cTnⅠ-T-C抗原浓度梯度稀释，以选择最适的检测抗体浓度。用碳酸盐包被液稀释Ab3至1 μg/ml，每孔加100 μl，4℃过夜。加200 μl 5%脱脂奶粉封闭2 h。分别稀释cTnⅠ-T-C抗原至400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/ml，每孔100 μl，37℃孵育1 h。检测抗体分别稀释500倍、1 000倍、2 000倍，每孔100 μl，37℃孵育1 h。分别加入50 μl 鲁米诺A、B显色液，显色10 min。酶标仪读取吸光度数值ODLum，分析数据。

(3)标准曲线的建立 固定捕获抗体Ab3和检测抗体Ab1-HRP的浓度，以抗原浓度为横坐标，以发光信号值为纵坐标，建立标准曲线。

(4)鲁米诺化学发光酶免疫分析方法对cTnⅠ-T-C、cTnⅠ、cTnⅠ-C三种存在形式的抗原的检测 固定捕获抗体Ab3和检测抗体Ab1-HRP的浓度，以抗原摩尔浓度为横坐标，以发光信号值为纵坐标，建立检测方法。

1.2.9临床样本的处理 采用临床 UniCel DxI 800仪器为金标准，对从医院收集的30例临床血浆进行检测分析，将两种方法的结果进行比较。用磷酸盐缓冲液将血浆作5倍稀释处理，取100 μl每孔加入于96孔酶联板中进行检测。

1.3统计学处理 本实验的数据通过GraphPad Prism 6 做图软件处理。数据组之间采用SPSS软件进行分析。

2 结果

2.1腹水型单克隆抗体纯化后蛋白浓度的测定和纯度的鉴定 通过BCA蛋白浓度检测试剂盒，BSA标准试剂浓度为纵坐标，对应的OD570值为横坐标建立蛋白质浓度标准曲线，得出拟合公式y=0.000 8x+0.063，将Ab1和Ab3的OD570值代入拟合公式得到：Ab1浓度为13.558 mg/ml， Ab3浓度为8.7 mg/ml。经过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳鉴定Ab1和Ab3纯度，结果显示(图1)，抗体重链和轻链的相对分子质量分别在50 kD和25 kD附近，未见明显杂带，纯化效果良好。

2.2两株单克隆抗体效价的测定 经过饱和硫酸铵粗纯和亲和层析Protein G柱纯化之后，包被人源的cTnⅠ-T-C抗原间接ELISA检测抗体效价，Ab1效价为1∶80万，抗体Ab3效价为1∶40万(图2)。

2.3最佳配对抗体的亲和常数测定 Ab1的亲和常数为1.62×109L/mol，Ab3的亲和常数为2.60×108L/mol(图3)。

图1 SDS-PAGE检测抗体的纯度Fig.1 SDS-PAGE tests purity of antibodiesNote:M.Protein marker;1.Ab1;2.Ab3.

图2 抗体的效价测定Fig.2 Determination of monoclonal antibody titer

2.4cTnⅠ和cTnⅠ-C鉴定两株抗体 用间接ELISA试验鉴定三株抗体是否能够结合cTnⅠ另外两种形式：cTnⅠ单体和cTnⅠ-C复合物。由图4可得两株抗体均能和cTnⅠ单体和cTnⅠ-C复合物结合。

2.5建立人心肌肌钙蛋白Ⅰ鲁米诺化学发光酶免疫分析法 在鲁米诺化学发光酶免疫分析法中，如果包被的抗体浓度过高，会浪费抗体，而且会造成非特异性结合；浓度过低，灵敏度会下降。因此需要对捕获抗体和检测抗体进行工作浓度的优化。

2.5.1捕获抗体浓度和检测抗体浓度的优化 包被抗体的浓度分别为2、1、0.5、0.25 μg/ml。当抗体浓度为1 μg/ml时，曲线变化明显，检测范围广，灵敏度高。确定最佳捕获抗体Ab3浓度为1 μg/ml(图5)。检测抗体(浓度为1.25 μg/μl)分别稀释500倍、1 000倍、2 000倍。当检测抗体稀释1 000倍时，检测灵敏度比另外两个稀释倍数下检测的灵敏度高，因此HRP-Ab1最佳工作浓度为稀释1 000倍(图6)。

图3 抗体亲和常数测定的曲线Fig.3 Curve of antibodies affinity constantNote:A.The curve of Ab1 affinity constant; B.The curve of Ab3 affinity constant.

图4 两株抗体与不同形式抗原的反应Fig.4 Reaction between two antibodies and different antigens

2.5.2标准曲线 固定捕获抗体Ab3的包被浓度为 1 μg/ml，固定检测抗体Ab1-HRP浓度为稀释1 000倍，以抗原浓度为横坐标，以发光信号值为纵坐标，建立标准曲线(图7)。标准曲线方程为y=423.6x-1 36，R2=0.998。确定检测范围6.25～400 ng/ml。

图5 捕获抗体工作浓度的优化Fig.5 Optimizing working concentration of capture antibody

图6 检测抗体工作浓度的优化Fig.6 Optimizing working concentration of detect antibody

2.6鲁米诺化学发光酶免疫分析方法对cTnⅠ-T-C、cTnⅠ、cTnⅠ-C三种存在形式的抗原的检测 见图8。

2.7临床样本的检测结果 用鲁米诺化学发光酶免疫分析法对30例临床血浆样本进行检测。以抗原浓度3.862 ng/ml为判断阴阳性的cutoff值。自制配对抗体(Ab3/Ab1-HRP)检测结果和临床 UniCel DxI 800仪器检测结果进行比较，统计分析准确率。检测结果如表1、2所示，22份阳性样本(表1中序号1～22号)，有5个弱阳性的样本检测结果为阴性，阳性样本检出率为77.3%，阴性样本检出率为100%。

2.8统计学分析结果 本实验建立方法与对照方法结果进行比较，采用SPSS软件分析，得到回归方程：y=1.019x-1.533，R2=0.994，P=0.9016>0.05 说明两组检测值具有高度线性相关性，差异无显著统计学意义，可以为临床样本检测提供参考(图9)。

图7 人心肌肌钙蛋白Ⅰ鲁米诺化学发光酶免疫分析标准曲线Fig.7 Standard curve of human cardiac troponin Ⅰ chemiluminescence enzyme immunoassay

表1两种检测方法所测的血浆cTnⅠ浓度/(ng/ml)的比较

Tab.1ComparisonofplasmacTnⅠconcentration/(ng/ml)measuredbytwodetectionmethods

MethodsPlasmasamples123456789101112131415UniCelDxl8002966274506700849304252647159622512660138281655517513230822361328224Ab3/Ab1⁃HRP3540357335923714379862806353703211316118341563217489217632211928182MethodsPlasmasamples123456789101112131415UniCelDxl800341764750355998641539683410448712023501960218025902730281028502860291Ab3/Ab1⁃HRP375074478756334671869219511048711746535323590360436273705381538403848

图8 检测cTnⅠ-T-C、cTnⅠ、cTnⅠ-C三种存在形式Fig.8 Detection of cTnⅠ-T-C,cTnⅠ and cTnⅠ-C

表2临床样本检测结果

Tab.2Resultofclinicalsamplesdetection

ItemsPositiveplasmasNegativeplasmasPositiverateNegativeratePlasmasamples228Ab3/Ab1⁃HRP178773%100%UniCelDxI800218955%100%

图9 两种检测方法相关性分析Fig.9 Correlation analysis of two detection methods

3 讨论

当心肌细胞因缺血或缺氧受到损伤时，心肌细胞内的cTnⅠ释放入血，外周血中的cTnⅠ主要以cTnⅠ-C或cTnⅠ-T-C复合物存在，复合物的形式使得cTnⅠ稳定存在，不易被降解。本研究建立的鲁米诺化学发光酶免疫分析检测方法可以同时检测不同形式的cTnⅠ，可以避免出现漏检的情况，且鲁米诺试剂灵敏度高，方法操作简单，非常适合AMI的快速检测。

研究证明，正常情况下外周血cTn浓度0.02～0.13 ng/ml，大于 0.2 ng/ml为临界值，超过0.5 ng/ml 可以诊断AMI[5]。本实验确定检测范围是 6.25～400 ng/ml，灵敏度有待提高。后续需要制备高亲和力的针对cTnⅠ单抗，可以对免疫原进行优化。cTnⅠ不稳定，容易降解，免疫原性差，本实验室可利用Discovery Studio软件，结合NCBI和IEDB等数据库提供的数据并分析cTnⅠ蛋白β转角、柔性、抗原性和亲水性[8]，从而预测cTnⅠ-T-C复合物的cTnⅠ亚基上的特异性抗原表位，选择cTnⅠ上的氨基酸序列分别偶联载体蛋白以形成抗原肽，生物信息学方法预测优势表位用于蛋白质功能鉴定已十分普遍[9]。一般所选取的肽段具有位于抗原表面、结构为简单的Loop结构、肽段的两端暴露在蛋白表面、长度在8～20个氨基酸残基等特点。获得的高亲和力抗体之后采用灵敏度更高的检测方法，可采用夹心免疫放射法和胶体金免疫层析法，灵敏度分别可达0.35、0.4 ng/ml[10,11]。

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