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(天津市动植物抗性重点实验室, 天津师范大学生命科学学院, 天津 300387)

纳米材料一般指结构单元尺寸为1～100 nm的材料，由于具有比表面积大和表面缺陷产生的一系列新的不同于宏观物质的效应(小尺寸效应、界面效应、量子效应和量子隧道效应)，在光学、热学、电磁学和化学等领域的应用研究都取得很大进展[1-2]。随着纳米材料的广泛应用，其在环境中的释放也不可避免，其中碳纳米材料的使用尤为突出，其潜在的影响和生态学风险引起各界的密切关注[3]。因此，在充分挖掘利用纳米材料的独特优越性、推动科技进步的同时，了解纳米材料对生物体的影响已经成为一个研究热点[4-5]。植物是生态系统的重要组成部分，揭示纳米材料对植物生长发育的影响及其机理十分重要。纳米材料对植物的生长和发育的影响研究开始时多集中于种子萌发，地上、地下部分，植物抗氧化酶等方面[6-7]，之后逐渐深入到对植物光合作用系统的影响[8]以及对植物基因表达[9]、内源激素、原生质体和细胞影响的研究[10-12]，在重金属胁迫下添加纳米材料对植物生长影响等领域也有相应的报道[13]。纳米材料的小粒径造就的小尺寸效应是影响植物生长发育的主要因素[12]。

在碳纳米材料对植物生长的影响研究中，碳纳米管对植物萌发生长的影响和毒理研究已有很多报道[14-15]，但石墨烯、氧化石墨烯的研究还相对较少。选择氧化石墨烯作为本实验碳纳米材料，一方面由于石墨烯边缘比氧化石墨烯锋利，在与细胞作用的过程中更易通过物理破坏伤害细胞[16]，另一方面由于氧化石墨烯表面含有大量的亲水性官能团，分散在水中时能够保持稳定，表面经过良好修饰的氧化石墨烯不论是在高盐溶液还是在生理条件下都能稳定存在，这为其在生物中的应用奠定了基础[17]。本试验选择中国北方常用的冷季型草坪草高羊茅作为研究对象，探究氧化石墨烯拌种对高羊茅种子萌发和幼苗生长的影响，为更加合理使用碳纳米材料，并探索发现其调节植物生长发育的规律、作用机制，揭示植物对纳米材料生态效应的反馈作用以及存在的风险提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

氧化石墨烯(Graphene oxide)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4～7 nm；片层直径10～50μm；层数5～10 层；比表面积100～300 m2/g；纯度>90%。

试验土壤取自天津师范大学院内0～20 cm的表层土壤，自然风干、碾碎、过筛、备用。土壤质地为砂质粘土，pH 值为7.45，其盐含量0.1%，有机质含量4.68%，全氮0.22%，全钾45.57%，有效磷22.12 mg/kg，电导率为1.38×103μS/cm，饱和含水量0.56 mL/g，容重0.87 g/cm3，总孔隙度为63.21% 。

草坪草选用我国北方常见禾本科植物高羊茅(Festucaarundinacea)。

1.2 植物培养

采用直径为7 cm、高为8 cm的塑料花盆，装入200 g自然风干后的土壤。选择籽粒饱满、大小均一的高羊茅种子，用3%的H2O2表面消毒10 min，无菌水冲洗3次，每次1～2 min，晾干[2]。0.25 g种子(约100粒)分别加入0.025，0.05，0.1，0.15 mg和0.2 mg氧化石墨烯混匀，即氧化石墨烯处理为0.1，0.2，0.4，0.6 mg/g和0.8 mg/g种子，以不加氧化石墨烯(0 mg/g)为对照，每个处理3次重复，均匀播撒于花盆中。植物培养期间室内温度 18～28 ℃，相对湿度为50%左右，光照为透入室内的自然光(600～28 000 lx)。每天补充水分，保证土壤含水量为最大持水量的70%，供植物正常生长所需。每天调换花盆的位置，保证受光一致。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 种子萌发参数的计算

从种子萌发开始，每天统计发芽种子数，连续观察记录10 d至种子萌发稳定。评价种子活力的参数包括发芽势(GE)、萌发率(GP)、萌发速率系数(CGR)、萌发值(GV)和萌发指数(GI)[18]，计算公式：

GE(%)=萌发4 d内发芽种子数/供试种子总数×100%;

GP(%)=n/N×100%(式中：n和N分别为萌发种子数和试验过程中所用种子总数)；

CGR=[∑(t·n)/∑n]×100(式中：t为自萌发试验开始时的天数，n为在t天内萌发的种子数)；

GV=MDG×PV(式中：MDG为平均每天萌发的种子数，PV为萌发试验期间平均每天的最大萌发种子数)；

GI=∑(Gt/Dt)(式中：Gt为时间t天的萌发种子数，Dt为萌发试验天数)。

1.3.2 植物生长指标测定

播种30 d后，每盆随机选取5株长势匀称的植株，取其平均株高。之后刈割，地上部分108 ℃下杀青20 min，80 ℃烘干至恒重，并称量。地下部分，用清水洗净，用滤纸吸去根外部的水分，80 ℃烘干至恒重，并称量。

1.3.3 叶绿素含量的测定

称取0.5 g新鲜叶片放入研钵中，加入纯丙酮、少许碳酸钙和石英砂研磨提取色素，用80%丙酮冲洗研钵，离心得到色素提取液，以80%丙酮为对照，分别测定663，645 nm处的光密度值，并根据公式计算叶绿素含量[19]。

1.4 数据处理

高羊茅种子萌发和幼苗生长效应评价采用隶属函数法[20]，计算公式如下：

R(Xj) = (Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin)。

式中，R为隶属函数值，Xj为第j个综合指标，Xmin、Xmax分别为第j个综合指标的最小值和最大值。然后用各指标的隶属函数值相加来计算综合评定值。

用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，采用Duncan法，在p=0.05水平进行数据差异显著性检验；采用Microsoft Excel 2007软件作图。

2 结果与分析

2.1 氧化石墨烯拌种对高羊茅种子萌发的影响

氧化石墨烯拌种对高羊茅种子萌发的影响如表1所示。与对照相比，氧化石墨烯没有显著影响发芽率，但是显著提高其他指数(p<0.05)。总体来看，0.2 mg/g氧化石墨烯处理表现最好，各萌发指数达到最高，与对照相比，萌发率、萌发势、萌发值、萌发指数、萌发速率系数分别提高了6.3%、20.7%、35.2%、31.6%和12.1%。对照处理除萌发率外，其它4个指数都是所有处理中最低的。

表1 氧化石墨烯拌种对高羊茅种子萌发的影响

处理(mg/g)萌发指数萌发率(%)萌发势(%)萌发速率系数萌发值萌发指数081.33±0.02ab55.67±0.01d7223.03±130.46c551.80±19.86d94.32±1.78e0.184.00±0.03ab76.33±0.03a7760.00±235.30ab686.83±38.88abc119.05±2.60bc0.287.67±0.02a76.33±0.01a8093.94±165.82a746.28±28.29a124.14±2.15a0.487.00±0.02ab73.33±0.02ab8007.88±176.59a728.26±30.14ab122.03±2.10ab0.683.00±0.02ab72.00±0.02bc7633.94±155.48abc662.48±23.97bc116.38±1.29cd0.881.00±0.04b69.00±0.01c7426.67±308.24bc627.15±45.05c113.04±2.21d

图1 氧化石墨烯拌种对高羊茅株高(A)和生物量(B,C)的影响

表3 氧化石墨烯拌种对高羊茅各指标影响的隶属函数分析

处理(mg/g)隶属函数值萌发率萌发势萌发速率系数萌发值萌发指数株高地上生物量地下生物量总叶绿素综合评定排名0000000001150.10.60.80.60.60.60.20.20.40.63.230.210.81110.8110.46.210.40.80.60.80.80.810.80.80.85.820.60.40.40.40.40.40.60.60.60.23.230.800.20.20.20.20.40.40.201.64

2.2 氧化石墨烯拌种对高羊茅株高和生物量的影响

氧化石墨烯拌种对高羊茅株高和生物量的影响如图1所示。和对照相比，氧化石墨烯显著提高了高羊茅的株高和生物量，且随氧化石墨烯用量的增加株高和生物量呈先增加后降低的趋势。0.2 mg/g氧化石墨烯处理的株高和地上、地下生物量达到最大，与对照相比，分别增加了23.02%、101.55%、70.27%。

2.3 氧化石墨烯拌种对高羊茅叶绿素含量的影响

如表2所示，添加氧化石墨烯对叶绿素a含量没有显著影响，但对叶绿素b的影响差异显著，高用量的氧化石墨烯显著降低了总叶绿素含量，与对照相比，0.8 mg/g处理总叶绿素含量降低了7.79%。

表2 氧化石墨烯拌种对高羊茅叶绿素含量的影响

处理(mg/g)叶绿素a(mg/g)(FW)叶绿素b(mg/g)(FW)总叶绿素(mg/g)(FW)01.429±1.337a0.482±0.408a1.912±1.558a0.11.416±0.530a0.433±0.352bc1.849±0.718ab0.21.408±1.298a0.424±0.242bc1.832±1.231ab0.41.403±0.656a0.447±0.236ab1.85±0.421ab0.61.371±0.991a0.407±0.542bc1.778±0.625b0.81.363±0.854a0.399±0.172c1.763±0.701b

2.4 氧化石墨烯拌种对高羊茅种子萌发和幼苗生长影响的效应评价

采用隶属函数法就氧化石墨烯拌种对高羊茅种子萌发和幼苗生长的影响进行评定(表3)。可以看出，添加氧化石墨烯促进高羊茅种子萌发和幼苗生长，0.2 mg/g处理高羊茅综合评定表现最好，排名第一。氧化石墨烯处理综合评定排名顺序依次为： 0.2，0.4，0.1，0.6，0.8，0 mg/g。

3 讨论与结论

种子萌发是植物后期生长的先决条件，研究氧化石墨烯对高羊茅种子萌发的影响十分重要。研究发现，氧化石墨烯使高羊茅种子萌发更快，种子活力提升，其中0.2 mg/g氧化石墨烯处理促进效果最好。Zhang等通过透射电子显微镜观察发现，石墨烯可以渗透番茄种皮，并且添加石墨烯的种子含水量高、发芽快、发芽率高[21]。Khodakovskaya等[11]通过碳纳米管处理番茄种子也得到类似的研究结果。普遍认为，纳米材料能够提高种子对水分和氧的吸收，从而增加种子活力，促进种子发芽[2,11,21-23]。

不同用量氧化石墨烯处理显著增加了高羊茅株高和生物量，并呈现先增加后减少的趋势。Zhang等也发现，石墨烯可显著提高番茄株高[21]，Khodakovskaya等[11]用碳纳米管处理后的番茄种子所得植株株高和鲜重显著高于对照，呈现低促高抑的趋势，说明适当用量的氧化石墨烯可以促进高羊茅生长。

研究结果显示，高用量的氧化石墨烯显著降低了总叶绿素含量，Hu等[24]、Zhang等[25]发现，纳米材料的处理会降低植物叶绿素的含量，刘尚杰等也有类似的研究结果，发现50 mg/L以上石墨烯处理的水稻与对照相比叶绿素含量明显降低，而低用量5 mg/L处理与对照相比显著提高[26]。

另外，对纳米材料如何影响植物根生长的机理进行了较多的研究。Cheng 等的研究发现，25 mg/L以上的石墨烯处理显著降低油菜根的生长，并发现根中生长素的含量下降但脱落酸的含量增加，其中5 mg/L石墨烯处理的油菜根中生长素和脱落酸与对照没有显著差异[27]。Jiao等也认为，氧化石墨烯通过ABA和IAA途径影响植物的生长[28]。生长素和脱落酸是根系结构和生长的最基本的分子信号。在石墨烯诱导的根细胞伸长过程中，激素介导的通路也可能起着至关重要的作用。本研究发现，氧化石墨烯使高羊茅地下生物量显著增加，可能与氧化石墨烯对生长素和脱落酸的影响有关，有待于进一步研究。

将测得数据进行隶属函数分析，提供了一种在多指标测定基础上对高羊茅萌发和生长进行综合评价的途径，避免了单一指标的片面性，能更好地揭示高羊茅的生长状况，提高评价的准确性；综合评定值越大，表明该剂量的氧化石墨烯拌种对种子萌发和幼苗生长的促进作用越明显。

综上所述，氧化石墨烯拌种促进了高羊茅种子萌发和幼苗生长，提高了种子的发芽势和幼苗株高、生物量，但是高用量处理会降低高羊茅的总叶绿素含量。采用隶属函数法就氧化石墨烯对高羊茅种子萌发和幼苗生长的影响进行综合评定，氧化石墨烯处理的高羊茅长势好于对照，以0.2 mg/g处理高羊茅综合评定表现最好。

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