潘传江，丁 杰，盛玉萍，王寿峰，刘 君

（四川理工学院分析测试中心，四川自贡643000）

1 材料与方法

1.1 试验材料

蛹虫草，广东金草行；虫草素标准品，中国药品生物制品鉴定所。

仪器：L－2000高效液相色谱仪，日立（中国）有限公司；RE52CS旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；WBFY－205微波反应器，巩义市科瑞仪器有限公司；AS5150B超声提取器，天津奥特塞恩斯仪器有限公司；标准检验筛，成都市企航仪器有限公司；索氏提取器，郑州兴化玻璃仪器厂。

试剂：石油醚、苯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯均为成都科龙化工试剂厂生产的分析纯试剂。乙腈、甲醇为色谱纯，所用试验用水均为去离子水。

1.2 蛹虫草虫草素的制备

取一定质量的蛹虫草，粉碎，过筛，经石油醚脱脂，干燥处理后备用。准确称量一定量的蛹虫草粉置于50 mL锥形瓶中，加入适量的按一定比例配制的提取溶液，放入微波－超声波仪中萃取，微波频率2 450 MHz，超声波频率40 kHz，一定时间后将提取溶液置于旋转蒸发仪浓缩至干，向锥形瓶中加入一定量的二氯甲烷，振荡使其充分溶解，过滤，得到目标产物。将目标产物溶于50%甲醇溶液，定容后用于检测分析［10］。

1.3 不同溶剂的考察

1.3.1 苯－无水乙醇 称取备用蛹虫草粗粉5.00 g，加4倍（体积质量比）量的溶剂（苯 ∶无水乙醇＝9∶1）于锥形瓶微波－超声提取50 min，趁热抽滤，连续用5.0 mL无水乙醇洗滤渣2次，合并滤液采用旋转蒸发仪直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗过滤，滤液定容到250.0mL，用HPLC法测定虫草素的含量。

1.3.2 甲苯－无水乙醇 称取备用蛹虫草粗粉5.00 g，加4倍（体积质量比）量的溶剂（甲苯∶无水乙醇＝9∶1）于锥形瓶超声提取50 min，趁热抽滤，连续用5.0 mL无水乙醇洗滤渣2次，合并滤液采用旋转蒸发仪直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗过滤，滤液定容到250.0mL，用HPLC法测定虫草素的含量。

1.3.3 环己烷－无水乙醇 称取备用蛹虫草粗粉5.00 g，加4倍（体积质量比）量的溶剂（环己烷∶无水乙醇＝9∶1）于锥形瓶超声提取50min，趁热抽滤，连续用5 mL无水乙醇洗滤渣2次，合并滤液采用旋转蒸发仪直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗过滤，滤液定容到250.0 mL，用HPLC法测定虫草素的含量。

1.3.4 乙酸乙酯－无水乙醇 称取备用蛹虫草粗粉5.00 g，加4倍（体积质量比）量的溶剂（乙酸乙酯 ∶无水乙醇 ＝9∶1）于锥形瓶超声提取50min，趁热抽滤，连续用5.0mL无水乙醇洗滤渣2次，合并滤液采用旋转蒸发仪直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗过滤，滤液定容到250.0 mL，用HPLC法测定虫草素的含量。

新建本科院校要改造图书馆的馆风，进而改造学风，是一项系统工程，既要从图书馆自身因素入手，也要改变外部因素。

1.3.5 二氯甲烷－无水乙醇 称取备用蛹虫草粗粉5.00 g，加4倍（体积质量比）量的溶剂（二氯甲烷 ∶无水乙醇 ＝9∶1）于锥形瓶超声提取50 min，趁热抽滤，连续用5.0 mL无水乙醇洗滤渣2次，合并滤液采用旋转蒸发仪直接旋干，加水溶解，玻璃漏斗过滤，滤液定容到250.0 mL，用HPLC法测定虫草素的含量。

1.4 蛹虫草虫草素提取的正交试验设计

选择料液比（A）、提取溶剂比（B）、提取时间（C）、提取功率（D）4个因素，每个因素选取3个水平，考察4个因素对蛹虫草中虫草素提取率的影响，以虫草素提取率作为考察指标，选用L9（34）正交试验进行筛选最佳方法（表1）。

表1 提取蛹虫草虫草素的正交试验因素及水平

1.5 蛹虫草虫草素的检测

1.5.1 虫草素标准溶液配制 准确称量0.005 0 g虫草素标准品，用50%甲醇溶液溶解，转移至5.0 mL容量瓶中，定容，得到1.0 mg／mL的虫草素标准储备液。用移液枪移取不同量的标准储备液分别稀释成10、50、100、150、200μg／mL的标准溶液，摇匀，冷藏待用。

1.5.2 供试品溶液的制备 准确称量一定量经脱脂后的蛹虫草粉于一体化反应器中，按料液比 1 g∶4 mL，溶剂甲苯∶无水乙醇为10 mL∶1 mL，提取时间为50 min，提取功率为60W，置于微波－超声波协同提取仪中，将仪器超声波打开，在选定的微波功率下提取，一定时间后将提取液置于旋转蒸发仪浓缩至干，加入一定量的二氯甲烷，振荡使其充分溶解，过滤，得到目标产物。将目标产物溶于50%甲醇溶液，定容后用于检测分析。

1.5.3 HPLC色谱条件 色谱柱为 ZORBAX Extend－C18柱（Analytical 4.6×250 nm 5－Micron 80 A），流动相为水 ∶甲醇 ＝95∶5，洗脱速率为 1.00 mL／min，柱温 35℃，进样量为10μL。

1.5.4 虫草素标准曲线的绘制 按照“1.5.1”节配制标准储备液，得到10、50、100、150、200μg／mL不同浓度的虫草素标准溶液。按照“1.5.3”节色谱条件进样，记录色谱图，测得峰面积S，以峰面积 S对浓度 C（mg／mL）作图，得到回归方程：y＝33 054x－41 890（r＝0.999），表明在 10～200μg／mL浓度范围内线性关系良好。按信噪比3倍（S／N）计算，得到虫草素的检出限（LOD）为1μg／mL。

1.5.5 蛹虫草中虫草素含量计算

2 结果与分析

2.1 虫草素HPLC检测波长的确定

紫外分光光度法全波长扫描虫草素标准品溶液，测定虫草素的紫外吸收光谱，从图1可以看出，虫草素在259 nm处出现最大吸收，因此选择HPLC的检测波长为259 nm。

2.2 HPLC流动相的选择

在试验过程先后选用KH2PO4缓冲溶液加四氢呋喃、水－乙腈、水－甲醇作为流动相，比较各条件的分离效果，选择最佳流动相。选用KH2PO4缓冲溶液加四氢呋喃作为流动相进样测定时，经过几次进样试验后，发现峰形逐渐变宽，经计算可知C18柱的柱效、理论塔板数都快速降低，要经过大量乙腈和甲醇冲洗活化后，才能使柱子勉强恢复到以前的效果。可见缓冲溶液对该柱子的损害作用很大，因此，KH2PO4缓冲溶液加四氢呋喃不宜作为流动相。当用水－乙腈作为流动相时，虫草素标准品和腺苷标准品虽然出峰时间比较短，但峰形很差且分离效果不佳。当水∶乙腈＝1∶9时，腺苷和虫草素的保留时间非常小且2个峰靠得很近，不能完全分开，彼此之间干扰较大，不适合用作分离的流动相。当增加或减少水的比例，2个标准品仍不能有效分离。而当用水和甲醇作为流动相时，虫草素标准品和腺苷标准品的保留时间略有延长，分离效果较好，且峰形窄而对称。用水∶甲醇体积比为9∶1作流动相保留时间出在可信度较高区域，但2个标准品的分离效果不是很好，当继续增大水的比例时，2个峰的分离度越来越高；当比例达到19∶1时，虽然保留时间稍有增加，但峰完全分离开且峰形对称尖锐、检测灵敏度高（图2）。当降低水的比例时虫草素后面有明显的拖尾，2个峰不能分离；而再加大水的比例虽然分离度稍好但保留时间延后很多，浪费时间、试剂，故选择水∶甲醇体积比为19∶1作为流动相。

试验结果表明，中性条件下分离效果较佳且色谱纯有机溶剂用量少、操作简便，且利于色谱柱的保护，使用寿命更长，有利于节约成本。色谱柱：ZORBAX Extend－C18柱（Analytical 4.6×250 nm 5－Micron 80 A）；柱温为35℃；流速为1 mL／min；流动相为甲醇 ∶水（体积比）＝1∶19；每次进样10μL；检测器检测波长259 nm。采用峰面积外标法定量。在此流动相条件下，对蛹虫草子实体提取液进行测定，虫草素与样品中其他杂质能够有效分开，无干扰，出峰时间适宜，分析稳定，分离效果见图3。由于子实体中含有的腺苷和虫草素的结构极其相似，在相同色谱条件下进样腺苷标准品（图4）。从图2、图3、图4比较可见，腺苷和虫草素的分离度相当大。

2.3 HPLC法绘制虫草素标准曲线

按照以上色谱条件进样测定“1.5.1”节所配标准溶液，记录测定的虫草素峰对应的面积S，以峰面积S对浓度C（μg／mL）作标准曲线（表2、图5）。通过线性回归得到回归方程：y＝33 054x－41 890，线性相关系数为 r＝0.999，表明在10～200μg／mL浓度范围内线性关系良好。按信噪比3倍（S／N）计算，得到虫草素的检出限（LOD）为1μg／mL。

表2 虫草素标准曲线数据

2.4 虫草素提取溶剂的选择

以虫草素提取率为指标，对虫草素提取所用有机溶剂配比的选择进行研究，粗提液定容到250.0mL，通过HPLC检测，利用标准曲线求得虫草素的含量，平行3次检测求平均值（表3）。

从表3可以看出，相对于其他溶剂和无水乙醇配比而言，甲苯、苯与无水乙醇配比作为提取剂，虫草素的溶出量较高；相较于单独的无水乙醇或去离子水，虫草素的溶出量也高出许多。这可能是由于在调节提取剂极性的同时在结构上也有相似的地方，虫草素有一个类似于苯环的六元环，根据相似相容原理，增加了虫草素的溶出；无水乙醇、水极性较大，对于本身极性较大的虫草素也有较好溶出效果，但是相比甲苯和苯与无水乙醇配比作为提取剂时还是相差较大，而且当用水或无水乙醇做提取剂时，同时被溶出的杂质含量较高，不利于虫草素更好地溶出；而其他几种常见有机溶剂作为提取剂时对体系可能只起到调节极性或一些影响较小的作用，这些因素占了提取剂大量比例而不利于虫草素的溶出。提取剂选用甲苯或苯与无水乙醇配比时虫草素的溶出量相差不大，但在甲苯和苯之间，相较而言，苯的毒性更大，吸入人体后不能被排解，对人体伤害更大，且价格更昂贵，故选择甲苯与无水乙醇配比作为提取剂。

表3 不同提取溶剂虫草素提取率

2.5 蛹虫草虫草素的最佳提取条件正交试验

超声－微波协同提取蛹虫草虫草素的正交试验各处理的虫草素提取率结果见表4。4因素极差值R的大小依次为A＞C＞B＞D，即各因素对虫草素提取率影响大小顺序为料液比＞提取时间＞溶剂比＞微波功率。

通过k值确定其最优水平为A3B3C2D3，即料液比为1 g∶5 mL，溶剂比为19mL∶1mL，提取时间为50min，微波功率为60W。在该最优条件下试验，其提取率为0.27%，提取率高于单因素结果，说明优化试验条件后其提取率得到提高。重复进行5次试验，其RSD为3.79%，重复性好，方案稳定可行。

3 结论

本试验利用微波－超声波法提取蛹虫草中虫草素，利用HPLC绘制虫草素的标准曲线，通过线性回归得到标准曲线方程为：y＝33 054x－41 890，r＝0.999，在10～200μg／mL浓度范围内线性关系良好。LOD：1μg／mL。对比了一系列提取剂对蛹虫草中虫草素提取的影响，发现用甲苯和水作为提取剂时效果最好，甲苯和高纯水的最佳配比为19 mL∶1 mL。通过正交试验得到其最佳提取条件为料液比为1 g∶5 mL，溶剂比为19 mL∶1 mL，提取时间为50 min，微波功率为60 W，在该条件下蛹虫草虫草素的提取率为0.27%。不同因素对虫草素提取贡献的大小顺序为料液比＞提取时间＞溶剂比＞微波功率。本试验过程中，结合超声波－微波协同处理蛹虫草提取虫草素，利用微波的高能作用和超声波的空化作用有助于提高虫草素的产量。

表4 超声－微波协同提取蛹虫草虫草素正交试验设计及结果

参考文献：

［1］马 力，丁向萍.虫草素抗肿瘤机制研究进展［J］.第四军医大学学报，2009，30（8）：764－766.

［2］陈顺志，高剑萍.一种超临界萃取虫草素脱氧核苷的生产方法：CN1339440［P］.2001－09－28.

［3］谢红旗，胡 瑕，罗 巍，等.酶法提取蛹虫草中虫草素的研究［J］.时珍国医国药，2011，22（9）：2145－2147.

［4］周英彪，刘 芳，张善信.微波－高效液相色谱法提取分离蛹虫草固体培养残基中的虫草素［J］.食品科学，2010，35（17）：224－226.

［5］钟艳梅，黄志全，温 凯.人工蛹虫草固体培养残基中虫草素的提取分离研究［J］.现代食品科技，2007，23（2）：40－42.

［6］Shih I L，Tsai K L，Hsieh C.Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordycepsmilitaris［J］.Biochemical Engineering Journal，2007，33（3）：193－201.

［7］Kubo E，Sato A，Yoshikawa N，et al.Effect of cordyceps sinensis on TIMP－1 secretion from mousemelanoma cell［J］.Central European Journal of Biology，2012，7（1）：167－171.

［8］Holbein SM，Werner T P.Cordycepin－hypersensitive growth links elevated polyphosphate levels to inhibition of poly（A）polymerase in Saccharomyces cerevisiae［J］.Nucleic Acids Research，2008，36（2）：353－363.

［9］王春华，毛 宁，安 康，等.液体发酵和固体栽培蛹虫草产生腺苷和虫草素情况［C］／／第八届全国食用菌学术研讨会暨新产品新技术交流会论文汇编，2007.

［10］Xu F L，Lee Y L，TsaiW Y，et al.Effect of cordycepin on Hantaan virus 76－118 infection of primary human embryonic pulmonary fibroblasts－characterization of apoptotic effects［J］. Acta Virologica，2005，49（3）：183－193.