胡耀华，阳慧，吴翔，符春苗，邵运禄，郑才玲，卓书伟

（海南省中医院 1.检验科，2.妇产科，海南 海口 570203）

甲型病毒性肝炎（hepatitis a virus，HAV）对人类健康危害极大，2001年MCINTIRE等[1]发现了1个新的基因T细胞免疫球蛋白域蛋白（T cell immunoglobulin domain and mucin domain，TIM）家族，包括TIM-1、TIM-3及TIM-4。TIM-1是HAV受体-1（hepatitis A virus cellular receptor 1，HAVCR-1），TIM-4是TIM-1的天然配体[2-4]。在HAV发生、发展和转归的不同阶段，目前国内外均未报道TIM-1、TIM-4的表达和作用。本研究拟通过检测HAV患者外周血TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平，探讨其与HAV的关系，为防治HAV提供新的思路和靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月-2016年10月海南省中医院收治的30例HAV患者作为HAV组。其中，男性21例，女性9例；年龄35～62岁，平均（46±1.3）岁。同期选取30例健康体检者作为对照组。所有患者依据临床症状、体征、肝功能检查结果及抗-HAV免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）阳性确诊为HAV，并根据临床症状和体征分为潜伏期、黄疸期及恢复期。参照2000年9月西安中华医学会传染病与寄生虫病学分会和肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案的标准[5]。

1.2 静脉血标本

根据HAV疾病进展的3个阶段，分别收集30例HAV-IgM阳性患者的静脉血标本。潜伏期或黄疸前期（患者畏寒发热、全身乏力、食欲不振、厌油、恶心、呕吐及上腹部饱胀感或轻度腹泻等）：采集乙二胺四乙酸二钾（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-K2）全血2 ml及不抗凝血3 ml分离血清；黄疸期（观察患者巩膜、皮肤黄染程度，第2～7天）：采集EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分离血清；恢复期（患者症状消失、肝脾正常，第22～42天）：采集EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分离血清。对照组分别在第1、7及30天采集静脉血，EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分离血清。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应

1.3.1 引物设计与合成应用生物信息学知识，根据GeneBank中的TIM-1和TIM-4 mRNA以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA全长序列，用Primer Express软件设计目的基因TIM-1、TIM-4和内参照基因GAPDH引物。TIM-1正向引物：5’-CTAGCTAGCGCCACCATG-3’，反向引物：5’-GGGGTACCTTAGTCCGTG-3’；TIM-4正向引物：5’-CCGCTACAGGCCTACCATGTCCA-3’，反向引物：5’-GGGGTACCGTTGGCATTG-3’；GAPDH正向引物：5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTCG-3’，反向引物：5’-TCTTGTGCAGTGCCAGCCT-3’。以上引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.2 外周血单个核细胞的获取及总RNA的提取与逆转录将Ficoll分离液和预先稀释的抗凝全血加入离心管中，2 000 r/min离心20min，小心吸取密集在血浆层和分层液界面中呈白色雾状的单个核细胞，经RPMI 1640细胞培养液调整细胞浓度为1×106个/L。用Trizol一步法抽提外周血单个核细胞总RNA，分析光密度（optical density,OD）260/OD280纯度，选取比值在1.8～2.0的样品进行检测，使用Thermo逆转录试剂盒进行逆转录。

1.3.3 反应条件采用美国Applied Biosystems公司的SYBR® Green PCR Core Reagents试剂盒。在专用检测板上配制各管反应液，总体系25μl。于聚合酶链式（polymerase chain reaction，PCR）反应仪中进行反应。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测体10×PCR缓冲液 2μl，25mmol/L Mg2+3.5μl，10mmol/L 高质量的脱氧核糖核苷酸0.4μl，10μmol/L引物各0.5μl，普通TaqDNA聚合酶1u（1 u/μl），SYBR Green I 20×1μl，灭菌H2O补齐。PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性10 s，59℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40个循环后分别进行荧光检测，并做熔解曲线对PCR产物的特异性进行鉴定，最后反应冷却至40℃。

1.3.4 HAV患者外周血HAV RNA含量qRTPCR反应条件同1.3.3，正向引物：5’-TCTTTGTTCCA GGGCTCTCC-3’；反向引物：5’-GCTCTTCCTCA ATGTCTGCC-3’。

1.4 酶联免疫吸附法

采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血中IgM和免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体，Cut-off值＜0.8为阴性，0.8～1.1为弱阳性（可疑），≥1.1为阳性。具体步骤：向相应微孔中加100μl标准品、阳性对照、阴性对照及待检标本。室温（18～25℃）温育30min，倒掉板内液体，用清洗缓冲液洗板3次，拍干，滴加酶结合物100μl/孔室温（18～25℃）温育30min，洗板3次，拍干，滴加显色液A和B各100μl，室温（18～25℃）避光温育15min后加终止液100μl，酶标仪450 nm处测Cut-off值。

1.5 肝功能检测

采用7600型全自动生化分析仪（日本日立公司）检测肝功能指标谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）及总胆红素（total bilirubin，TBIL）。使用血清标本，方法参照仪器和试剂盒说明书。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用Kruskal-Wallis H检验（方差不齐），独立样本两两比较用Nemenyi检验，相关分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平比较

由qRT-PCR反应曲线得到Ct值，计算基因相对表达量，采用GAPDH作为内参照。ΔCt=Ct目的基因－CtGAPDH。其中HAV患者TIM-1和TIM-4 mRNA的Ct值分别为38.029～3.272logX（r=0.927）、32.719～2.582logX（r=0.975）。两组患者在HAV感染的不同时期TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（H=4.768，P=0.013），HAV组高于对照组，其表达水平较潜伏期升高数倍，黄疸期达峰值，恢复期降低，但仍高于对照组。两组患者恢复期TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（H=3.963，P=0.027）。不同时期的TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（H=11.975和15.482，均P=0.000）；潜伏期与恢复期TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 两组患者TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平比较

2.2 HAV患者不同时期TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平与HAV RNA含量的相关性

由qRT-PCR反应曲线得到Ct值，计算基因相对表达量，采用GAPDH作为内参照。ΔCt=Ct目的基因－CtGAPDH。 得 Ct=40.049～ 3.579logX（r=0.955）。TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平的变化趋势与HAV mRNA表达水平一致，于黄疸期达峰值（r=0.752，P=0.035）。其中HAV在潜伏期、黄疸期及恢复期的阳性率分别为13.3%（4/30）、100%（30/30） 和 46.7%（14/30）。 其mRNA表达水平于黄疸期增高，最高达7.2×104Copies。

2.3 HAV患者外周血TIM-1、TIM-4 mRNA表达水平与HAV抗体、IgM及IgG滴度的相关性

由ELISA法测得外周血中HAV抗体IgM和IgG水平。不同时期IgM、IgG及HAV RNA比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中IgM潜伏期就有较高水平，随着病情不断进展于黄疸期达峰值，恢复期下降，黄疸期、潜伏期和恢复期比较，差异有统计学意义（H=11.221和9.478，均P=0.000）。而IgG在潜伏期水平较低，黄疸期和恢复期持续升高，潜伏期与黄疸期、恢复期比较，差异有统计学意义（H=5.324和7.332，P=0.011和0.002）。HAV RNA黄疸期与潜伏期、恢复期比较，差异有统计学意义（H=6.145和4.234，P=0.003和0.023），潜伏期与恢复期比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Pearson相关性分析发现，HAV患者病情进展不同时期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表达水平与IgM滴度变化呈正相关（r=0.790和0.900，均P=0.000）。HAV患者不同时期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表达水平与IgG滴度变化无关（P＞0.05）。见表1、2。

2.4 HAV患者不同时期TIM-1、TIM-4 mRNA表达水平与ALT、AST及TBIL含量的相关性

ALT、AST及TBIL 3个指标均从潜伏期开始增加，至黄疸期达峰值，进入恢复期后逐渐下降并恢复正常。Pearson相关性分析发现，HAV患者不同时期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表达水平与AST、TBIL含量呈正相关（P＜0.05），ALT含量与TIM-1 mRNA表达呈正相关（P＜0.05）。其中TIM-1、TIM-4 mRNA 表达水平与TBIL含量的最相关。见表2。

表1 HAV患者病情进展不同时期IgM、IgG及HAV RNA水平比较 （±s）

表1 HAV患者病情进展不同时期IgM、IgG及HAV RNA水平比较 （±s）

时期 IgM/（IU/L） IgG/（IU/L） HAV RNA潜伏期 1 115.000±594.392 273.334±181.589 1 506.667±531.906黄疸期 3 193.334±1 478.800 1 361.667±611.342 4 4445.591±1 4445.912恢复期 270.000±165.237 1 461.667±547.358 940.025±1 265.892 H值 11.771 9.972 14.087 P值 0.000 0.000 0.000

表2 HAV患者不同时期TIM-1、TIM-4 mRNA表达水平与IgM、IgG滴度，ALT、AST及TBIL含量的相关性

3 讨论

本实验结果显示，HAV患者血清中有较高的TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平，且高于健康人群。其表达水平与HAV患者HAV RNA、IgM滴度及肝功能损伤水平成正相关。

TIM-1集成表达于T细胞表面，作为一种辅刺激分子，对T细胞的调节有重要作用，可以促进细胞因子的分泌，增强NKT细胞杀伤能力，以及调节增强肿瘤抗原相关的1型免疫反应。鼠系研究表明，TIM-4是TIM-1的天然配体，集成性表达于抗原提呈细胞，特别是成熟的树突状细胞[5-6]。同时发现TIM-4可诱导TIM-1胞内尾巴区酪氨酸磷酸化，从而提供1个共刺激信号，增强白细胞介素-4启动子的转录，并激活T细胞核因子转录和活化蛋白-1促使T细胞增殖和细胞因子产生[7-8]。在T细胞增殖调控方面，TIM-1和TIM-4协同作用有重要意义[9]。同时TIM-1作为HAV的细胞表面受体，可能参与HAV的发生[6]。笔者研究发现，在HAV患者潜伏期，HAV RNA、IgM水平还处于较低水平时，TIM-1和TIM-4 mRNA表达水平相比于健康人群升高，其灵敏性高于前者。推测HAV在感染肝细胞前可能先与TIM-1病理性结合从而激活NKT细胞，给NKT细胞提供增殖信号，使NKT细胞大量复制，参与肝细胞的免疫损伤。相关研究也发现，HAV与TIM-1结合可以介导病毒插入靶细胞膜并进入宿主细胞，具体过程为HAV与TIM-1的D1结构域结合，吸附到易感细胞表面，在黏膜样区域的协同作用下，HAV外壳蛋白的结构发生变化，将病毒表面与细胞融合相关的区域暴露出来，HAV与TIM-1融合，随着融合孔增大，HAV继而插入靶细胞膜并进入宿主细胞[4,10-11]。

1例HAV患者发生肝衰竭，其血清中TIM-1和TIM-4 mRNA呈高表达，且迅速发生黄疸。其肝功能急剧恶化，HAV RNA水平却在检测下限，同时HAV IgM也呈低表达，这可能是由于HAV不是本身攻击肝细胞，而是其抗原所导致的一种免疫损伤。这与国外人群研究，严重肝衰竭HAV患者血清中有着低浓度的病毒载量结论一致[11]。也有阿根廷HAV患儿的研究表明，HAV感染从无症状疾病到暴发性肝衰竭与HAV RNA的病毒载量无关，而与TIM-1多态性（TIM-1长形式）相关，严重HAV诱导的肝衰竭可能与长形式TIM-1结合甲肝病毒有效率有关[8,12]。

笔者研究发现，相比于HAV RNA病毒载量和HAV IgM水平，TIM-1和TIM-4 mRNA水平对于HAV的发病及预后的预测更加灵敏，但是实验对于预测的特异性没有深入研究，接下来将对TIM-1和TIM-4 mRNA在HAV的具体发病机制作进一步研究。相信对TIM家簇基因与疾病的相关研究，必将加深人们对HAV免疫发病机制的理解，为HAV的预防、诊断和治疗提供新思路。

参 考 文 献：

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