刘颖迪 柏冰雪 任静 马良娟

024000内蒙古，赤峰市医院皮肤科（刘颖迪）；哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科（柏冰雪、任静、马良娟）

皮肤光损伤的基础是日光紫外线照射，细胞受到光损伤后会诱发光老化和各种皮肤癌。皮肤发生光损伤主要是因为长波紫外线和中波紫外线（UVB），其中UVB因其损伤强度大，角质形成细胞发生光损伤后产生一系列损伤因子作用于成纤维细胞，加重光老化［1］。因此，研究皮肤光老化防护对延缓皮肤衰老和预防皮肤良恶性肿瘤有重要意义。紫外线作用于皮肤引起细胞光损伤的一个重要机制是诱导活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生［2］。胆绿素（biliverdin）是血红素氧合酶催化血红蛋白产生的代谢产物，在胆绿素的生物学作用中，其抗氧化作用尤为突出［3⁃4］。前期动物实验中我们已经证实，外源性胆绿素可以延缓UVB诱导的裸鼠慢性皮肤光老化［5］。本研究中，我们建立UVB光损伤细胞模型，在细胞和分子水平上研究胆绿素在细胞光损伤中的防护作用，并通过观察胆绿素对抗氧化应激的重要信号分子——核因子-红细胞 2 相关因子 2（nuclear factor⁃erythroid 2⁃related factor⁃2，Nrf2）的影响探讨胆绿素拮抗皮肤光损伤的机制。

材料与方法

一、细胞、主要试剂

HaCaT细胞由哈尔滨医科大学附属第二医院实验室提供。胆绿素配制：胆绿素盐酸盐为美国Sigma公司产品，纯度 ＞ 97.0%（10 mg；货号30891），将其溶于2 mol/L NaOH溶液中，DMEM培养基产于美国HyClone公司。CCK8产于日本同仁公司；Nrf⁃2抗体产于美国CST公司；基质金属蛋白酶1（MMP⁃1）、MMP⁃3抗体产于武汉博士德生物工程有限公司。UVB灯管（K5B20H，波长290～320 nm，波峰313 nm）产自南京华强电子有限公司；紫外线照度表（UV340B）产自深圳欣宝瑞仪器有限公司。

二、细胞培养

取HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、95%湿度及5%CO2条件下培养传代。取对数生长期HaCaT细胞，经0.5%胰蛋白酶和0.03%乙二胺四乙酸消化后，用DMEM培养基以1×105个/ml细胞密度接种于6孔板（用于Western印迹实验）或96孔培养板（用于CCK8实验）中，当细胞融合至80%以上且处于对数生长期时处理，倒置显微镜下观察HaCaT细胞的形态。

三、细胞分组和处理

将HaCaT细胞分为5组，对照组：不加胆绿素，不照射UVB；UVB组：30 mJ/cm2UVB照射，不加胆绿素；100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 胆绿素 +UVB组：分别于30 mJ/cm2UVB照射前1 h加入相应浓度胆绿素。各个孔板内细胞生长融合至80%以上时，吸去UVB组和胆绿素+UVB组培养液，用PBS冲洗1次，并加入少量PBS覆盖底面，用UVB照射，培养板距灯管15 cm，照射总剂量为30 mJ/cm2。照射完毕后，弃去PBS，重新加入新鲜的DMEM培养基继续培养24 h。

四、CCK8法检测细胞生存率

上述各组细胞继续培养24 h后，向每孔加入10 μl CCK8，继续培养4 h，于酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度（A值），细胞生存率=（实验孔A值-空白孔A值）（/对照孔A值-空白孔A值）×100%。

五、Western印迹检测MMP⁃1、MMP⁃3和Nrf⁃2蛋白表达

上述各组细胞继续培养24 h后，加预冷的PBS冲洗3遍，加入含苯甲基磺酰氟的裂解液冰上裂解30 min，然后于4℃下12 830×g离心10 min，吸取上清液。二辛可酸法检测总蛋白浓度。各组蛋白加入5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE）蛋白上样缓冲液，煮沸变性，SDS⁃PAGE（预制胶）上样，使用聚偏二氟乙烯膜进行湿转后，5%脱脂牛奶封闭1 h，加相应一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL发光液显影，化学发光凝胶成像仪成像、拍照。

六、统计学处理

数据的统计分析采用SPSS 19.0软件。数据用±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、UVB照射前后HaCaT细胞的形态变化

正常的HaCaT细胞形态饱满，多角形，呈扁平铺路石样紧密排列。30 mJ/cm2UVB照射后继续培养24 h，HaCaT细胞皱缩，胞质成分缩减，边缘锐利且细胞之间排列疏松。

二、胆绿素预处理、UVB照射对HaCaT细胞活力的影响

CCK8结果显示，对照组、UVB组和100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L胆绿素 +UVB组细胞吸光度值分别为3.001±0.122、0.988±0.135、1.466±0.106、1.588± 0.118、1.943± 0.102（n=8）。与对照组比较，UVB组细胞生存率显著降低（P＜0.05）；与UVB组比较，各浓度胆绿素+UVB组细胞生存率均升高（P＜0.05），各浓度胆绿素+UVB组间细胞生存率差异有统计学意义（P＜0.05）。

三、胆绿素抑制UVB诱导HaCaT细胞中MMP⁃1和MMP⁃3蛋白表达

Western印迹结果显示（图1，表1），与对照组比较，UVB组MMP⁃1和MMP⁃3表达均增加（P＜ 0.01）；在加入100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L胆绿素预处理后，MMP⁃1、MMP⁃3蛋白表达与UVB组比较均下降（P＜ 0.05），且100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L胆绿素+UVB组组间MMP⁃1和MMP⁃3表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。

四、胆绿素诱导UVB照射HaCaT细胞中Nrf2蛋白表达

与对照组相比，UVB组HaCaT细胞中Nrf2蛋白表达降低（P＜ 0.05），而100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L胆绿素+UVB组中Nrf2蛋白表达较UVB组增加（P＜0.01）。见图1，表1。

图1 5组HaCaT细胞中基质金属蛋白酶（MMP）⁃1、MMP⁃3及Nrf⁃2蛋白表达

表1 各组HaCaT细胞MMP⁃1、MMP⁃3及Nrf⁃2蛋白相对表达水平

讨 论

胆绿素是血红蛋白的代谢产物，它再经还原酶催化生成胆红素，胆绿素和代谢产物胆红素都具有抗氧化作用。研究发现，同等条件下每分子胆绿素和胆红素可以分别清除4.7和1.9分子氧自由基，胆绿素清除氧自由基的能力比胆红素更有效，而且胆绿素可以同时清除1e⁃和2e⁃氧化剂，还可以与膜结合的α生育酚起到有效协同作用，抑制细胞膜脂质过氧化［6］。本研究中我们发现，30 mJ/cm2UVB照射后继续培养24 h，HaCaT细胞皱缩，胞质成分缩减，边缘锐利且细胞之间排列疏松。与对照组相比，UVB组细胞存活率明显下降，而经胆绿素预处理的HaCaT细胞组细胞存活率较UVB组明显升高，且呈剂量相关性，说明胆绿素对UVB诱导的光损伤有一定保护作用。

MMP是皮肤光老化发生的一个关键酶，可导致皮肤皱纹产生和弹性降低。而皱纹形成与光损伤密切相关，抑制MMP产生就可以抑制皱纹的形成。所以抑制MMP产生已经作为防止光损伤的重要策略，而减少MMP产生的天然材料一样可以防止光损伤［7］。本研究显示，UVB照射可诱导MMP⁃1和MMP⁃3蛋白表达，加入一定浓度胆绿素预处理后，可以有效抑制MMP⁃1和MMP⁃3蛋白表达，进一步证实胆绿素对UVB诱导的细胞光损伤有防护作用。

Nrf2是一种含有亮氨酸拉链基本结构的核转录因子，通过编码抗氧化性的保护蛋白调节细胞内氧化还原反应，并通过与抗氧化反应元件（ARE）相互作用，构成Nrf2/ARE通路——细胞抗氧化反应的中枢调节［8］。当外界氧化还原环境发生变化或通过信号转导系统诱导后，可以激活这个通路，启动下游靶基因，发挥抗氧化、抗炎症、抗凋亡和维持内环境稳定等作用，Nrf2/ARE通路在许多与氧化应激反应有关的疾病中发挥作用［9］。研究报道，Nrf2缺失或激活障碍，会增加细胞对UV照射的敏感性，Nrf2/ARE通路在细胞光损伤中发挥保护作用［10］。近年研究表明，UVB照射HaCaT细胞后Nrf2蛋白表达水平降低，应用Nrf2活化剂可以有效激活Nrf2抗氧化应激通路，参与并对抗氧化应激［11］。本研究证实，UVB照射后HaCaT细胞中Nrf2蛋白表达降低，但加入一定浓度胆绿素预处理HaCaT细胞后，Nrf2蛋白表达升高，提示胆绿素可作为Nrf2因子的活化剂，通过诱导Nrf2基因和蛋白的表达拮抗UVB照射引起细胞光损伤，其机制可能与Nrf2抗氧化应激通路相关。

综上所述，UVB可以诱导HaCaT细胞发生光损伤，降低细胞存活率，外源性胆绿素可以有效提高细胞生存率，对细胞光损伤起到一定防护作用，其作用机制可能与Nrf2抗氧化应激通路有关。

参考文献

［1］Kammeyer A,Luiten RM.Oxidation events and skin aging［J］.Ageing Res Rev,2015,21:16⁃29.doi:10.1016/j.arr.2015.01.001.

［2］Watson RE,Gibbs NK,Griffiths CE,et al.Damage to skin extracellular matrix induced by UV exposure［J］.Antioxid Redox Signal,2014,21（7）:1063⁃1077.doi:10.1089/ars.2013.5653.

［3］Kosaka J,Morimatsu H,Takahashi T,et al.Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats［J/OL］.PLoS One,2013,8（5）:e63606.doi:10.1371/journal.pone.0063606.

［4］Jansen T,Hortmann M,Oelze M,et al.Conversion of biliverdin to bilirubin by biliverdin reductase contributes to endothelial cell protection by heme oxygenase⁃1⁃evidence for direct and indirect antioxidant actions of bilirubin［J］.J Mol Cell Cardiol,2010,49（2）:186⁃195.doi:10.1016/j.yjmcc.2010.04.011.

［5］Bai B,Liu Y,You Y,et al.Intraperitoneally administered bili⁃verdin protects against UVB ⁃induced skin photo⁃damage in hairless mice［J］.J Photochem Photobiol B,2015,144:35⁃41.doi:10.1016/j.jphotobiol.2015.02.001.

［6］MacLean PD,Chapman EE,Dobrowolski SL,et al.Pyrroles as antioxidants:solvent effects and the nature of the attacking radical on antioxidant activities and mechanisms of pyrroles,dipyrrinones,and bile pigments［J］.J Org Chem,2008,73（17）:6623⁃6635.doi:10.1021/jo8005073.

［7］Pallela R,Na⁃Young Y,Kim SK.Anti⁃photoaging and photo⁃protective compounds derived from marine organisms［J］.Mar Drugs,2010,8（4）:1189⁃1202.doi:10.3390/md8041189.

［8］Guo H,Zheng Y,Wang B,et al.A note on an improved self⁃healing group key distribution scheme［J］.Sensors（Basel）,2015,15（10）:25033⁃25038.doi:10.3390/s151025033.

［9］Muthusamy VR,Kannan S,Sadhaasivam K,et al.Acute exercise stress activates Nrf2/ARE signaling and promotes antioxidant mechanisms in the myocardium［J］.Free Radic Biol Med,2012,52（2）:366⁃376.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2011.10.440.

［10］Soeur J,Eilstein J,Léreaux G,et al.Skin resistance to oxidative stress induced by resveratrol:from Nrf2 activation to GSH biosynthesis［J］.Free Radic Biol Med,2015,78:213 ⁃223.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2014.10.510.

［11］Kim M,Park YG,Lee HJ,et al.Youngiasides A and C isolated from youngia denticulatum inhibit UVB⁃induced MMP expression and promote type I Procollagen production via repression of MAPK/AP⁃1/NF⁃κB and activation of AMPK/Nrf2 in HaCaT cells and human dermal fibroblasts［J］.J Agric Food Chem,2015,63（22）:5428⁃5438.doi:10.1021/acs.jafc.5b00467.