邓蕙妍 李华平 陈荃 李润祥 梁碧华 高爱莉 周欣 朱慧兰

510095广州市皮肤病防治所皮肤科

白藜芦醇是具有较好防护作用的抗氧化剂［1］，其中核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路的激活是其发挥抗氧化作用的主要机制之一。紫檀芪是白藜芦醇的衍生物，与白藜芦醇相比，其生物利用度更高［2］，对Nrf2有较强的激活作用［3］。既往对紫檀芪抗氧化作用的研究集中在乳腺、心血管系统、消化系统、血液系统、代谢系统和神经系统等，其主要作用表现为减少活性氧簇（ROS）生成、增加过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽氧化酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）等表达［4⁃6］，而紫檀芪对皮肤作用的研究仅限其抗癌作用［7］。紫檀芪能否作为紫外线防护剂，预防皮肤急性氧化损伤还未见报道。为探讨紫檀芪对人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）急性光损伤的保护作用，本研究探讨紫檀芪干预前后经中波紫外线（UVB）照射的HaCaT细胞损伤程度、Nrf2核转位及下游抗氧化酶变化。

材料与方法

一、细胞、试剂和仪器

HaCaT细胞（广州吉妮欧生物科技有限公司）。紫檀芪纯合物（纯度≥97%，美国Sigma公司），细胞活性检测试剂盒（美国Promega公司），膜联蛋白V-藻红蛋白凋亡检测试剂盒（美国BD Biosciences公司），核蛋白-胞质蛋白提取液（美国Thermo Fisher Scientific公司），M⁃MLV反转录酶（美国Promega公司，M1705），GoTaq®qPCR Master Mix（美国Promega公司，A6002），一步法RNA提取试剂盒（Trizol，美国MRC公司，TR118⁃500），抗Nrf2抗体、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素（武汉博士德生物工程有限公司）。ELISA检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），UVB灯管，波长范围290～320 nm，峰值297 nm，功率40 W（北京电光源研究所）；Tanon电泳仪（上海天能科技有限公司）；基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司）。

二、实验方法

1.HaCaT细胞急性光损伤模型构建：参考本课题组前期研究结果［8］，使用57 mJ/cm2UVB，每次照射光源与细胞的垂直照射距离为15 cm，取对数生长期细胞在超净台内照射，完成后换为培养基继续培养18 h。

2.筛选无毒性的紫檀芪浓度：HaCaT细胞随机分为对照组、各浓度紫檀芪组（2.44、4.88、9.75、19.5、39、78和156 μmol/L），分组加好药物后37 ℃培养24 h。加入MTS试剂，37℃孵育0.5 h后，酶标仪检测490 nm波长处吸光度（A值）。

细胞按上述分组处理24 h后，无乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化并收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2次。用1×结合缓冲液重悬细胞为1 × 106个/ml，取100 μl上述悬液至流式管中，分别加入膜联蛋白V 5 μl和7氨基放线菌素D 5 μl，混匀，室温避光孵育15 min，加入400 μl结合缓冲液混匀后1 h内，采用流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡和坏死率，即细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死率之和。

3.Western印迹法检测HaCaT细胞内Nrf2核转位：HaCaT细胞随机分为对照组、UVB组、紫檀芪组、紫檀芪+UVB组。对照组：正常培养，不做任何处理；UVB组：UVB照射（同实验方法1）；紫檀芪组：HaCaT细胞分别与2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪在37℃共培养24 h；紫檀芪+UVB组：HaCaT细胞分别与2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪在37 ℃共培养24 h后，接受UVB照射（同实验方法1）。吸去培养液，胰酶消化成细胞悬液，终止消化后600×g离心5 min。吸弃上清，加入胞质蛋白提取液Ⅰ和胞质蛋白提取液Ⅱ，经剧烈振荡和离心，上清液即为胞质蛋白；剩下的沉淀加入预冷的胞核蛋白提取液，重复振荡和冰上放置、离心，上清液即为胞核蛋白，收集细胞蛋白后，1∶500稀释，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测胞核蛋白和胞质蛋白，以3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，1∶5 000）和组蛋白H3（1∶2 000）作为内参照，计算上述蛋白表达量，设定对照组的第一个值为1，其他组与其相比较得出上述蛋白表达的差异。

4.定量PCR检测CAT和SOD mRNA表达水平：按照“二、3”中方法分组处理HaCaT细胞后，Trizol提取总RNA后，以M⁃MLV反转录酶进行逆转录，随后采用GoTaq®qPCR Master Mix进行qPCR反应。qPCR引物序列见表1。以β肌动蛋白为内参，根据2⁃△△Ct计算CAT和SOD mRNA的相对表达量。

5.ELISA检测CAT和SOD活性：将HaCaT细胞按实验方法3分组处理，收集上清液，按照ELISA检测试剂盒操作说明检测CAT和SOD活性。

三、统计学分析

采用SPSS19.0统计软件分析，计量资料用±s表示。无毒性紫檀芪浓度的确定实验结果采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD法。紫檀芪及UVB照射对HaCaT细胞胞质与胞核中Nrf2表达、CAT和SOD mRNA表达及活性的影响实验数据采用析因设计的方差分析，多重比较采用Tukey法。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 qPCR引物序列

结 果

一、紫檀芪浓度的确定

0、2.44、4.88、9.75、19.5、39、78和156 μmol/L紫檀芪处理HaCaT细胞24 h后，HaCaT细胞增殖活性（A值）分别是1.442±0.004、1.437±0.002、1.428±0.002、1.415 ± 0.005、1.357 ± 0.002、1.263 ± 0.006、1.071±0.029、0.885±0.002。各组间HaCaT细胞增殖活性差异有统计学意义（F=1 497.661，P＜0.01）。两两多重比较显示，2.44和4.88 μmol/L紫檀芪组细胞增殖活性与对照组相比，差异无统计学意义（P=0.512、0.061），而9.75、19.5、39、78、156 μmol/L紫檀芪组细胞增殖活性显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.44、4.88、9.75、19.5、39、78和156 μmol/L紫檀芪组HaCaT细胞凋亡与坏死率分别为3.53%±0.12%、4.58% ±0.52%、8.06% ±0.97%、8.97% ±0.68%、9.70%±1.04%、14.53%±1.13%和19.75%±0.97%，各组间差异有统计学意义（F=3912.3，P＜0.001），且随紫檀芪浓度增加，HaCaT细胞凋亡与坏死率逐渐增加。与对照组相比，紫檀芪浓度低于9.75 μmol/L时，细胞凋亡与坏死率变化不明显（P＞0.05）；浓度为9.75 μmol/L时，凋亡与坏死率开始出现轻微变化（P=0.05）。

结合细胞增殖和凋亡结果，紫檀芪浓度≤9.75 μmol/L时，对HaCaT细胞没有损伤。因此，确定下一步实验中紫檀芪浓度为2.44、4.88和9.75μmol/L。

二、HaCaT细胞内Nrf2核转位情况

见图1、表2。析因分析显示，紫檀芪对HaCaT细胞内Nrf2胞质和胞核蛋白的作用受UVB影响（胞质蛋白交互作用F=7.408，P=0.02，胞核蛋白交互作用F=16.148，P＜ 0.001）。Tukey检验显示，2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪组与对照组相比，Nrf2胞质蛋白（q分别为0.06、0.52、3.07，P＞ 0.05）和胞核蛋白（q分别为0.24、3.02、4.76，P＞ 0.05）无明显变化；UVB组与对照组相比，Nrf2胞质蛋白无明显变化（q=1.86，P＞0.05），而Nrf2胞核蛋白显著增加（q=17.24，P＜ 0.01）。

2.44、4.88和9.75 μmol/L紫檀芪 +UVB组与对照组相比，Nrf2胞质蛋白浓度均显著下降（q分别为6.96、6.90、9.92，均P＜ 0.05），胞核蛋白浓度则显著升高（q分别为31.85、36.30、24.46，均P＜ 0.01）；与UVB组相比，Nrf2胞质蛋白浓度均显著下降（q分别为5.329、5.069、12.30，均P＜ 0.05），胞核蛋白浓度则显著升高（q分别为14.61、19.06、7.23，均P＜ 0.01）。

图1 不同浓度紫檀芪及UVB作用HaCaT细胞后胞质Nrf2蛋白、胞核Nrf2蛋白浓度变化 1：对照组；2～4：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪组；5：UVB组；6～ 8：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪 +UVB组

表2 不同浓度紫檀芪及UVB作用HaCaT细胞后胞质和胞核Nrf2蛋白相对表达水平（±s）

表2 不同浓度紫檀芪及UVB作用HaCaT细胞后胞质和胞核Nrf2蛋白相对表达水平（±s）

注：n=3

分组对照组2.44 μmol/L紫檀芪组4.88 μmol/L紫檀芪组9.75 μmol/L紫檀芪组UVB组UVB+2.44 μmol/L紫檀芪组UVB+4.88 μmol/L紫檀芪组UVB+9.75 μmol/L紫檀芪组胞质内Nrf2 1.03±0.08 1.03±0.09 1.06±0.09 1.01±0.07 1.14±0.11 0.86±0.10 0.87±0.11 0.46±0.11胞核内Nrf2 1.04±0.11 1.12±0.13 1.24±0.07 1.37±0.10 1.77±0.08 2.38±0.11 2.57±0.11 2.07±0.13

三、HaCaT细胞内CAT、SOD mRNA表达

见图2。qPCR显示，UVB照射会降低HaCaT细胞内CAT mRNA表达（F=276.569，P＜0.001），但不会降低SOD mRNA表达（F=1.923，P＞0.05），不同浓度紫檀芪亦会影响CAT、SOD mRNA表达（CAT：F=6.63，P=0.004；SOD：F=16.82，P＜ 0.001），且受UVB的影响（CAT交互作用F=3.78，P=0.032；SOD交互作用F=10.63，P＜0.001）。

如图2显示，UVB组CAT表达显著低于对照组（P＜0.05），而SOD表达无明显变化（P＞0.05）。各浓度紫檀芪组与对照组相比，CAT和SOD的表达均无明显变化（P＞0.05）。各浓度紫檀芪+UVB组与对照组相比，CAT表达显著下调（P＜0.05），SOD表达显著上调（P＜0.05）；与UVB组相比，CAT和SOD的表达均明显上调（P＜0.05）。不同浓度紫檀芪组间CAT、SOD mRNA的表达差异均无统计学意义。

图2 不同浓度紫檀芪和（或）UVB处理HaCaT细胞后过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）mRNA表达 1：对照组；2：UVB组；3 ～ 5：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪组；6 ～ 8：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪+UVB组。与未接受UVB照射及紫檀芪处理的对照组相比，a：P ＜ 0.001，b：P ＜ 0.05，c：P ＜ 0.01

图3 不同浓度紫檀芪和（或）UVB处理HaCaT细胞后过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性变化 1：对照组；2：UVB组；3 ～ 5：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪组；6 ～ 8：2.44、4.88、9.75 μmol/L紫檀芪+UVB组。与未受UVB照射及紫檀芪处理的对照组相比，a：P ＜ 0.01，b：P ＜ 0.05；与UVB组相比，c：P ＜ 0.05，d：P ＜0.01

四、CAT和SOD活性检测结果

见图3。UVB照射可显著降低HaCaT细胞内CAT和SOD活性（CAT：F=161.565，P＜ 0.001；SOD：F=1 766.747，P＜0.001），不同浓度紫檀芪亦可显著影响CAT和SOD活性（CAT：F=8.277，P=0.001；SOD：F=7.83，P=0.002），紫檀芪对细胞内CAT、SOD活性的作用受UVB的影响（CAT交互作用F=5.161，P=0.011；SOD交互作用F=10.219，P=0.001）。

如图3显示，UVB组与对照组相比，CAT和SOD活性均显著下调（P＜0.05）。各浓度紫檀芪组与对照组相比，CAT和SOD活性均无明显变化（P＞0.05），且不同浓度紫檀芪组间差异均无统计学意义。各浓度紫檀芪+UVB组与对照组相比，CAT和SOD的表达均显著下调（P＜0.05），与UVB组相比则有明显上升（P＜0.05）。

讨 论

紫外线分为长波紫外线、UVB和短波紫外线，短波紫外线在经过地球表面臭氧层时被过滤掉，对皮肤无影响，UVB主要作用于表皮，长波紫外线穿透深度大于UVB，主要作用于真皮和真皮下层。HaCaT细胞作为表皮的主要成分，受UVB影响较大。研究表明［9］，UVB引起皮肤光损伤的机制复杂，其中，氧化应激损伤是造成皮肤红斑、水肿等急性炎症反应的重要原因。面对氧化应激损伤，人类皮肤配备完善的自身抗氧化防御机制，其中最为重要的是调控抗氧化物酶和Ⅱ相解毒酶，如GSH、CAT、SOD及血红素加氧酶1（HO⁃1）等基因表达的Nrf2［10］。生理条件下，Nrf2 在胞质中与胞质蛋白Kelch样ECH联合蛋白1（Keap1）结合后被蛋白酶水解；氧化应激条件下，Nrf2从Keap1上解离，从胞质进入胞核与小分子蛋白Maf识别元件（MARE）位点结合，形成异二聚体并与ARE结合，调控下游抗氧化物酶和Ⅱ相解毒酶基因的转录，重新维持细胞内氧化还原水平［11］。本研究及前期研究［12］均发现，在没有添加抗氧化剂的情况下，UVB照射可使胞核Nrf2蛋白有所增加，但Nrf2胞质蛋白的含量没有明显变化，提示无Nrf2核转位，表明UVB照射引起HaCaT细胞急性损伤时，细胞内Nrf2通路不能自行启动，无法起到抗氧化作用。

既往研究表明，CAT可催化细胞内过氧化氢分解，防止氧化损伤。SOD是生物体内清除自由基的首要物质［4］。结合我们的实验可知，UVB照射可抑制细胞内CAT和SOD的表达和活性，影响细胞的抗氧化活性，引起细胞光损伤。在HaCaT细胞中预先添加紫檀芪，再经一定剂量的UVB照射，HaCaT细胞内发生Nrf2核转位，Nrf2调控的CAT和SOD表达上调，活性增加，证明紫檀芪可通过激活细胞内Nrf2通路，上调下游CAT和SOD表达，激活其抗氧化活性，起到防御细胞氧化损伤的作用。但是，SOD活性增加幅度较小，是否意味着与CAT相比，紫檀芪对SOD活性的影响较小？推测紫檀芪的作用主要是通过CAT催化过氧化氢分解，防止氧化损伤，而非通过SOD清除自由基。但这一推断还需要进一步实验验证。本课题组还发现另一种天然植物抗氧化剂茶多酚在促进Nrf2 mRNA和核蛋白的表达及分布的同时，可抑制核转录因子Bach1核蛋白的表达及分布［13］。因此，紫檀芪激活Nrf2通路是否也与抑制Bach1相关，除此通路以外是否还有其他机制参与其中，均需进一步实验探讨。

参考文献

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