刘远征 漆艳香 曾凡云 丁兆建 何壮 彭军 张欣 谢培兰 谢艺贤

摘 要 本研究克隆并鉴定香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc4）β1-微管蛋白（β1-tub）基因，采用Split-marker同源重组技术获得Foc4的β1-tub基因敲除突变体，通过测定突变体菌株的生长速度、產孢量、致病力及对多菌灵敏感性，研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及对多菌灵抗药性中的作用。结果表明：与Foc4野生型菌株相比，敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形及产孢量增加，对巴西蕉苗的致病力明显减弱，但对多菌灵的抗性水平无明显变化。由此推测β1-tub基因可能在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要的作用。

关键词 香蕉枯萎病菌；β1-微管蛋白；基因敲除；致病力

中图分类号 S436.681 文献标识码 A

Functional Analysis of the β1-tubulin Gene in Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race 4

LIU Yuanzheng1，2， QI Yanxiang2， ZENG Fanyun2， DING Zhaojian2， HE Zhuang1，2，

PENG Jun2， ZHANG Xin2， XIE Peilan2， XIE Yixian2*

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract In this study， the β1- tubulin （β1-tub） gene in F.oxysporum f. sp. cubense race 4 （Foc4） was cloned and identified. The gene-knockout mutants of β1-tub gene in Foc4 were obtained by split-marker homologous recombination technique. The growth rate， sporulation， pathogenicity and sensitivity to carbendazim of the mutant strain were studied to investigate the effects of β1-tub on the growth， development and carbendazim resistance in Foc4. The results demonstrated that the knockout mutants of β1-tub showed slow growth， the hyphal deformity and increased conidium production， and significantly decreased pathogenicity to banana （Cavendish， AAA）， but no significant change in the resistance level to carbendazim when compared with the wild type isolate of Foc4. Therefore， we hypothesized that the β1-tub gene might play an important role in the growth， sporulation and pathogenicity of Foc4.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense； β1- tubulin； gene knockout； pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.017

由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）引起的香蕉枯萎病是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传维管束病害，已给香蕉产业造成了巨大的经济损失。在实际生产中，使用化学杀菌剂、生物药剂对香蕉枯萎病防治的效果并不理想。种植抗（耐）病品种是当前该病综合治理中最为有效的方法之一。然而，目前生产上栽培的较抗（耐）枯萎病香蕉品种均是通过体细胞无性系变异获得的，通过无性变异获得的抗耐病品种易因病原菌的进化而逐渐丧失抗病性[1]。

苯并咪唑类杀菌剂（如多菌灵及以多菌灵为主的混/复配药剂）具有广谱、 高效、作用靶标位点单一和内吸性等特点，被广泛用于防治镰刀菌引起的植物病害[2-3]。该类杀菌剂主要作用于病原菌的β-微管蛋白，阻止菌体形成纺锤体，进而抑制有丝分裂，但由于药剂作用位点单一，病原菌在药剂选择压力下较易产生抗药性[4-5]。已有研究结果表明，多菌灵对香蕉枯萎病有一定防预作用[6]，但效果不太理想。

目前，由于缺乏理想的化学药剂、抗病品种等防治措施，香蕉产业面临着极大的威胁。近年来，对于香蕉枯萎病的致病机理与致病相关基因的研究已经在G蛋白、过氧化氢酶、MAPK通路等方面取得了一定进展[7-11]。对于β-微管蛋白的研究主要集中在其突变所产生的抗药性等方面[12]。

为了阐明香蕉枯萎病菌中β1-微管蛋白基因是否在抗药性及在病原菌致病过程中发挥作用，利用同源重组的原理获得了该基因的敲除突变体，并对敲除突变体的生长速度、产孢量、致病力及对多菌灵敏感性等生物学特性进行分析，完善该基因的具体功能，为香蕉枯萎病菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂产生的抗药性及其致病机理的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和香蕉品种 香蕉枯萎病菌4号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，Foc4），由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组鉴定保存。试验接种用香蕉品种为巴西蕉（Cavendish，AAA）（5～7片叶）。

1.1.2 供试药剂 使用前将98%多菌灵原药（湖北康宝泰精细化工有限公司）溶解于0.1 mol/mL盐酸中，配成10 mg/mL的母液，然后用无菌水将母液稀释配成1 mg/mL工作液。

Congo Red（刚果红，CR）购于北京拜尔迪生物技术有限公司；Calcofluor White Stain（荧光增白剂，CFW）购于北京的sigma-aldrich。

1.2 方法

1.2.1 Foc4野生型菌株对多菌灵的敏感性测定 参照曾凡松等[13]的方法对供试菌株进行多菌灵敏感性测定。将Foc4野生型菌株的菌饼接种到0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 μg/mL 7个处理终浓度的多菌灵PDA平板中。28 ℃下培养 7 d，每个处理重复3皿，试验重复 3次。最终计算抑制中浓度EC50。

1.2.2 香蕉枯萎病菌基因组DNA的制备 将野生菌株接种到PDA培养基上，28 ℃培养7 d，收集新鲜菌丝，液氮速冻。基因组DNA提取按照Biomiga Fungal gDNA Kits（Biomiga）说明书进行。

1.2.3 β1-微管蛋白基因克隆与分析 根据已完成测序的香蕉枯萎病菌热带4号生理小种菌株54006的β1-微管蛋白基因（β1-tub）核酸序列（GenBank登录号：JH658279.1），在ORF两端设计基因特异性引物对：TUBU1-2F（5′-AATAGCCTGGAAGGAACCGC-3′）/ TUBU1-2R（5′-ATGTCAAGTCCCTGCTCGCA -3′）。PCR扩增反应在PTC200 PCR仪（MJ RESEARCH）上进行。PCR反应总体积25 μL，其中10× PCR 缓冲液 （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTPs混合物（2.5 mmol/L）2 μL，引物对各0.5 μL（20 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），DNA 模板100 ng，无菌超纯水补足至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

PCR产物经回收后连接到T-Vector pMD19（Simple）载体上，转化E. coli DH5α，将获得的阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。将测得序列与GenBank数据库进行同源性分析，通过BLAST搜索分析β1-微管蛋白基因的同源性，用Clustal X （2.0）软件进行多序列比对，采用MEGA 6.0软件以邻近相接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树。

1.2.4 β1-tub基因敲除重组片段扩增 根据Foc4基因组DNA测序序列，采用Split-marker重组技术进行PCR扩增获得β1-tub基因敲除重组片段。设计引物FOC4TUB-LBCK和FOC4TUB-HPH-LB-R、FOC4TUB-HPH-RB-F和FOC4TUB-RBCK扩增β1-tub基因上下游片段；设计引物HYG-F和HYG-R扩增潮霉素（HYG）基因片段；重组PCR用引物FOC4TUB-LB-F和HYG-R1、HYG-F1和FOC4TUB-HPH-RB-F来扩增上下游片段，所有引物序列见表1。

1.2.5 原生质体制备及转化 Foc4野生型菌株原生质体制备参照王飞燕等[14]的方法。PEG介导的原生质体转化参照徐齐君等[15]的方法，略作修改。分别取50 μL的上下游重組片段，缓慢加入到300 μL原生质体中，轻轻混匀，室温放置20 min；缓慢滴加1.5～2 mL PTC溶液，室温放置20 min；将上述反应液加入到再生培养基（含有100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL潮霉素B）中，混匀后，倒于培养皿上；于 28 ℃培养 3～7 d后获得转化子，并连续培养3代获得稳定转化子。

1.2.6 β1-tub敲除突变体鉴定 采用CTAB法[16]提取Foc4与抗性转化子的基因组DNA，根据β1-tub基因上游片段和潮霉素基因序列设计引物FOC4TUB-LBCK和HPT-RBCK（表1），根据潮霉素基因序列和β1-tub基因下游片段设计引物HPT-LBCK和FOC4TUB-RBCK（表1），根据β1-tub基因全长设计内源特异引物TUB1-CKFP和TUB1-CKRP，根据潮霉素全长片段设计特异引物HYG-F和HYG-R（表1），利用这4对引物对转化子进行PCR鉴定，引物TUB1-CKFP/TUB1-CKRP无扩增条带，而引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK、HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK和HYG-F/HYG-R可扩出目的片段的转化子为阳性β1-tub基因敲除突变体。

提取Foc4野生型菌株和β1-tub基因敲除突变体菌株的RNA，反转录为cDNA后，以Foc4野生型菌株的cDNA模版为对照，引物actin-F/actin-R为内参，引物QRT-TUB1-F/QRT-TUB1-R为β1-tub特异引物进行实时定量PCR验证敲除突变体。

1.2.7 β1-tub敲除突变体对多菌灵的敏感性测定 将β1-tub敲除突变体接种到含有不同浓度多菌灵的PDA平板中，方法同1.2.1，其中Foc4作为对照，并计算β1-tub敲除突变体的抑制中浓度EC50值。

1.2.8 β1-tub敲除突变体生长特性分析 生长形态和生长速率测定：将Foc4和β1-tub敲除突变体的5 mm 新鲜菌饼接种到PDA平板上，于28 ℃培养，分别在接种后2、4、6、7 d 观察拍照，并于每天测量菌落直径，每次设3个重复。

产孢量分析：分别从长有β1-tub敲除突变体和Foc4（均培养了7 d）的 PDA平板上打7 mm的菌饼3个，加入无菌水后震荡打碎，然后采用血球计数板计数，每次设3个重复。

菌丝显微观察：分别从长有β1-tub敲除突变体和Foc4（均培养了7 d）的PDA平板上取少量菌丝到载玻片上，制片后进行显微观察。

1.2.9 β1-tub敲除突变体对胁迫因子的敏感性分析 Foc4和敲除突变体菌株在PDA平板活化7 d，打取7 mm的菌饼分别接种于含有Congo Red（终浓度100 μg/mL）、Calcofluor White Stain（终浓度100 μg/mL）、NaCl（终浓度0.7 mol/L）、H2O2（终浓度4 mmd.L-1）的minimal medium（MM）平板上，以未处理的MM平板作为对照，28 ℃培养7 d后观察并拍照记录，计算抑菌率，每次设3个重复。抑制率=（对照组菌落直径-试验组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。

1.2.10 β1-tub敲除突变体致病性测定分析 分别将Foc4野生型菌株和敲除突变体接种于100 mL的PDB培养液中，置于28 ℃、160 r/min的摇床中恒温震荡培养3 d，过滤收集分生孢子，用无菌水重悬分生孢子，悬浮液至106个孢子/mL。采用盆栽伤根淋灌法测定菌株的致病性。Foc4与敲除突变体均处理15株巴西蕉苗，每株苗浇20 mL孢子悬浮液，以无菌水作为对照，设3次重复。按照常规方法栽培管理，30 d后纵向切开巴西蕉球茎，观察球茎褐变程度及外部叶片黄化情况，参考Mohamed等[17]的病情调查分级标准，记录每株蕉苗的发病级别并进行病情指数的统计分析。

2 结果与分析

2.1 野生菌株对多菌灵敏感性测定

由图1可知，生长7 d后，Foc4野生型菌株对多菌灵表现为敏感，其中EC50=0.51 μg/mL。

2.2 β1-tub基因的序列分析和同源性比较

Foc4的β-微管蛋白基因全长1 670 bp，GenBank登陆号为MF668108。该基因序列包含4个内含子和5个外显子，编码1个由446个氨基酸残基组成的蛋白。

经BLAST分析和Clustal X比对，Foc4中β1-tub基因的氨基酸序列，与轮枝样镰刀菌（F. verticillioides，XP_018748359.1）、尖孢镰刀菌番茄专化型（F. oxysporum f. sp. lycopersici，XP_018241948.1）、禾谷镰刀菌（F. graminearum，AAP68979.1）等几种常见植物病原真菌的β1-tub氨基酸序列高度同源（图2）。

2.3 β1-tub基因敲除重组片段扩增与突变体获得

采用Split-marker重组技术原理进行PCR扩增（图3-A），扩增目的条带如图3-B所示，第一轮PCR扩增的上下游片段，大小约为1 938、1 858 bp，同时扩增出潮霉素（HYG）基因片段，大小约为1 376 bp；第二轮PCR扩增出用于原生质体转化的上下游重组片段，大小约为2 419、2 136 bp。

2.4 β1-tub敲除突变体的鉴定

2.4.1 β1-tub敲除突变体PCR验证 经过再生培养和潮霉素抗性筛选，共获得20个转化子。分别提取Foc4和转化子的基因组DNA，以其为模版，用引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK、HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK、HYG-F/HYG-R和TUB1-CKFP/TUB1-CKRP进行PCR扩增。将20個转化子进行初步检测，发现有9个为阳性转化子，以其中3个转化子的基因组DNA为模版，用引物FOC4TUB-LBCK/HPT-LBCK和HPT-RBCK/FOC4TUB-RBCK进行PCR扩增，分别扩增出约2.3、2 kb的2个条带，与预计大小一致，以Foc4基因组DNA为模版扩增作为对照（图4-A）。用引物HYG-F/HYG-R进行PCR扩增，获得约1.4 kb的条带，与预计大小一致，以Foc4为对照（图4-B）。用引物TUB1-CKFP/TUB1-CKRP进行PCR扩增，无扩增条带，以Foc4基因组DNA为模版扩增得到约0.7 kb的条带（图3-C），与预计大小一致。这些结果表明这3个转化子的β1-tub基因已被敲除，故将其分别命名为Δβ1-tub-1、Δβ1-tub-2和Δβ1-tub-3。选取Δβ1-tub-1敲除突变体作为研究对象进行以下研究。

2.4.2 β1-tub敲除突变体QPCR验证 将Foc4野生型菌株、Δβ1-tub-1、Δβ1-tub-2和Δβ1-tub-3敲除转化子进行实时定量PCR验证。由图5可知，β1-tub敲除突变体不再表达β1-tub基因，说明这3个转化子的β1-tub基因已被敲除。

误差线代表3次生物学重复的标准误差，不同小写字母代表在p<0.05水平下差异显著。下同。

The error line represents the standard error of three biological repetitions， and different small letters represents a significant difference when p<0.05. The same as below.

2.5 β1-tub敲除突变体对多菌灵敏感性测定

将Foc4野生型菌株和Δβ1-tub菌株分别接种到含有不同浓度多菌灵的PDA平板中，生长7 d后，测定Δβ1-tub菌株对多菌灵的敏感性。结果表明，Δβ1-tub对多菌灵的敏感性（EC50=0.53 μg/mL）与Foc4野生型菌株对多菌灵的敏感性（EC50=0.51 μg/mL）无明显差异（图6），说明β1-微管蛋白敲除突变体对多菌灵的抗性无明显变化。

2.6 β1-tub基因敲除突变体的生长特性分析

2.6.1 β1-tub基因敲除突变体的生长速度和产孢量分析 将Δβ1-tub和Foc4野生型菌株分别接种于PDA平板上并培养7 d，每天测量菌落直径。结果表明，生长7 d后，Foc4野生型菌株菌落已长满整个平板，而Δβ1-tub菌落生长缓慢，菌落直径约为Foc4菌落的1/5（图 7-A、B）。计算平板菌落生长的孢子产量，Foc4的孢子产量约为0.937×106/mm2，Δβ1-tub的孢子产量约为2.704×106/mm2（图7-C），表明Δβ1-tub的产孢量增加。通过光学显微镜观察Foc4和Δβ1-tub的菌丝，结果发现Δβ1-tub的菌丝生长出现畸形（图7-D、E）。

2.6.2 β1-tub基因敲除突变体对胁迫因子的敏感性分析 在含有100 μg/mL CR（Congo Red）和100 μg/mL CFW（Calcofluor White）条件下，Foc4野生型菌株和Δβ1-tub突变体菌株的生长均受到不同程度的抑制，其中，Foc4较Δβ1-tub抑制程度更明显；在含0.7 mol/L NaCl的培养基上，Foc4和Δβ1-tub均表现出一致的长势，生长没有受到抑制；在含4 mmol/L H2O2 的培养基中，Foc4和Δβ1-tub的生长均受到不同程度的抑制，Foc4较Δβ1-tub抑制程度更明显（图8）。上述结果表明，β1-tub敲除突變体对细胞壁选择性压力、氧化压力和渗透压均不敏感。

2.7 β1-tub基因敲除突变体的致病性

将Foc4和β1-tub基因敲除突变体菌株Δβ1-tub分别接种巴西蕉（Cavendish，AAA）幼苗。30 d后观察，结果发现接种野生菌株的巴西蕉苗叶片出现黄化枯萎现象，植株下部叶片大部分褪绿、变黄，且切开球茎观察到球茎部位褐化严重，病害严重度达到3～4级；而接种Δβ1-tub菌株的巴西蕉苗与接种H2O的对照巴西蕉苗均未出现叶片黄化现象，且球茎无褐化现象（图9-A）。根据病情指数统计结果显示，接种Δβ1-tub菌株的巴西蕉苗平均病情指数（12.50）显著低于Foc4接种的平均病情指数（52.92）（图9-B）。这表明β1-tub基因在Foc4的致病性方面起着重要作用。

3 讨论

在真核生物中，微管由微管蛋白（tubulin）和微观辅助蛋白（MAPs）两大类蛋白组成，作为细胞骨架的重要组分而普遍存在。微管是由α和β-微管蛋白以异二聚体形式组装而成，α-微管蛋白和β-微管蛋白在真核蛋白中具有高度保守性，参与细胞形态、维持有丝分裂和其它各种形态事件的发生[18]。而β-微管蛋白是微管结构最主要的成分之一，同时也是多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的作用靶标[19]。

真菌基因组仅有一个或2个β-微管蛋白基

因[20]。在禾谷镰刀菌中，2个β-微管蛋白基因得到鉴定[21]。β-微管蛋白作为多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的作用靶标，大多数病原真菌对苯并咪唑类药剂的抗性与β-微管蛋白的变化有关。其中，灰葡萄孢菌对苯并咪唑类药剂的抗性是由于β1-微管蛋白的变化引起，而禾谷镰刀菌不是由于β1-微管蛋白的变化引起抗药性[22]。在香蕉枯萎病菌中，本研究克隆并鉴定了其β1-微管蛋白基因，其氨基酸序列高度保守，并与其它常见植物病原真菌的β1-微管蛋白基因的氨基酸高度同源。本研究利用同源重组原理获得了β1-微管蛋白基因的敲除突变体，与野生菌株相比，敲除突变体对多菌灵敏感性稍有下降，其EC50值与野生型菌株无显著差异，说明β1-微管蛋白基因敲除突变体不具有对多菌灵的抗性，这与于俊杰[23]研究小麦赤霉病中β1-微管蛋白基因敲除突变体对多菌灵的敏感性结果一致，推测在香蕉枯萎病菌中还可能存在其它微管蛋白的作用，并不是由于β1-微管蛋白的变化而引起的抗药性。

本研究中，β1-微管蛋白基因缺失突变体的生物学表型与野生菌差别显著，突变体表现为生长缓慢、菌丝畸形及产孢量增加，这与毕朝位[24]在研究禾谷镰刀菌β1-微管蛋白基因敲除突变体的生物学表型与野生菌差异不显著的研究结果存在差异。同时，本研究结果发现β1-微管蛋白基因的缺失造成香蕉枯萎病菌的致病力减弱，与仇剑波[25]研究禾谷镰刀菌β1-微管蛋白基因敲除突变体在花期小麦穗子上的致病力降低是一致的。综上所述，虽然β1-微管蛋白基因在进化过程中存在高度保守性，但不同植物病原菌的β1-微管蛋白具有不同的功能。β1-微管蛋白基因的敲除导致香蕉枯萎病菌生长缓慢，产孢增加，不能正常侵染寄主，推测β1-微管蛋白基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及致病力等方面发挥着重要功能，但对香蕉枯萎病菌致病性的具体调控机制还需进一步研究。

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