张红娜 刘胜辉 孙伟生 李运合 孙光明 林文秋 张秀梅 吴青松

摘 要 為了解造成2种不同类型菠萝品种对乙烯敏感性差异的发生环节，进一步揭示乙烯促进菠萝成花的分子机制，本研究以乙烯敏感型‘巴厘菠萝品种和乙烯钝感型‘台农16菠萝品种为试材，对乙烯催花过程中成花基因及乙烯信号转导途径中乙烯受体、信号转导和核内调控等过程涉及基因的表达特征进行了分析。结果表明：AcERS1a、AcETR2a、AcETR2b、AcCTR1、AcENI2和AcERFs等基因在2种成花类型中的差异可能是导致2个品种对乙烯信号感知敏感度不同的重要原因；AcERS1a、AcERS1b、AcETR2a和AcETR2b等乙烯受体可能参与乙烯诱导菠萝成花信号的感知，然后通过AcCTR1下调和AcENI2上调将信号转导至核内调控基因（AcEIN3和AcERFs），从而启动菠萝成花关键基因AcFT和花器官形态建成重要基因AcAP1的表达，引起菠萝成花的生物学效应，这将为进一步阐明乙烯诱导菠萝成花的分子机制提供参考，也为利用基因工程手段开展菠萝新品种选育研究奠定了基础。

关键词 菠萝；乙烯；信号转导；受体；基因表达

中图分类号 S668.3 文献标识码 A

Ethylene Induced Sensitivity of Difference Pineapple Varieties

ZHANG Hongna， LIU Shenghui， SU Weisheng， LI Yunhe， SUN Guangming， LIN Wenqiu，

ZHANG Xiumei， WU Qingsong*

Key Laboratory for Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture/ South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract In order to explore the sensitivity difference to ethylene between ethylene sensitive cultivar ‘Bali and ethylene insensitive cultivar ‘Tainong 16， and further clarify the molecular mechanisms of flowering induced by ethylene in pineapple， the expression profiles of flowering genes and ethylene-related genes during floral induction were studied by the real-time quantitative PCR method. Results showed that the expression difference of AcERS1a， AcETR2a， AcETR2b， AcCTR1， AcENI2 and AcERFs during flower-bud formation might be the main reasons causing the difference in ethylene sensitivity of the two cultivars. The ethylene receptors AcERS1a， AcERS1b， AcETR2a and AcETR2b might participate in signal perception of flowering induced by ethylene， then by down-regulation of AcCTR1 and up-regulation of AcENI2， the signal was transmited to AcEIN3 and AcERFs， to initiate the expression of flowering genes AcFT and AcAP1， and raise the biological effects of floweing. The study would provide a reference to clarify the molecular mechanism of pineapple flowering induced by ethylene， and provide scientific bases for genetic engineering breeding.

Key words pineapple； ethylene； signal transduction； ethylene receptors； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.008

菠萝[Ananas comosus（L.）Merr]，凤梨科凤梨属多年生单子叶草本，是世界三大热带水果之一[1]。菠萝苗生长到一定程度或叶片达到一定数量可自然成花，但菠萝自然开花易受个体营养差异及温度、水分和栽培环境等外界因素影响，导致开花时间不一致和开花率低等问题[2-3]。因此，生产上多采用人工诱导开花的方式，即当菠萝达到一定营养生长量之后，喷施乙烯利等生长调节剂诱导其成花，这种方式既能保证菠萝在市场上的周年供应，又能调节开花时间一致易于管理。目前，利用乙烯利对菠萝进行人工诱花（生产上俗称“催花”）已成为菠萝生产中普遍使用的栽培技术[4-6]。在我国，菠萝栽培品种相对单一，‘巴厘和‘卡因是目前的主栽品种，其中‘巴厘约占全国的80%以上[7]。近年来，随着本地品种种性退化及市场对菠萝品质需求的多样化，国内对菠萝新品种引进及推广工作也日益升温，但新品种（如台农系列）试种及推广中发现菠萝不同品种间对乙烯利诱花的敏感度存在较大差异[8-9]。对于一些果实品质优良但难以催花（对乙烯不敏感）的品种，生产中一般选择淘汰或任其自然开花来获得一定的产量，这严重影响了果实品质优良品种的引种和良种推广工作。目前，造成不同品种对乙烯敏感度差异的原因尚不清楚，因此系统深入研究乙烯诱导菠萝开花的内在机理尤为必要。

近年来，借助分子生物学和遗传学的方法，植物乙烯信号转导途径已逐步被阐明，在拟南芥中确立了一条从定位于内质网膜的乙烯受体到核内转录因子的线性信号转导途径（linear signal transduction pathway）[10]。乙烯受体是该途径中最上游的感应元件，在拟南芥中发现有5个乙烯受体，分别为ETR1（ethylene response 1）、ETR2（ethylene response 2）、ERS1（ethylene response sensor 1）、ERS 2（ethylene response sensor 2）和EIN2（ethylene insensitive 2），受体下游是乙烯信号转导途径的负调控因子CTR1（constitutive triple response 1）[11～14]；EIN2位于CTR1的下游，是乙烯信号转导途径中的正调控因子；EIN3（ethylene insensitive 3）/EIL1（EIN3 like 1）是位于EIN2的初级转录因子[12，15-16] 。乙烯受体蛋白结合乙烯后抑制了CTR1的磷酸化能力，激活膜蛋白EIN2，使得转录因子EIN3/EIL1在核内稳定表达[11-14]；EIN3蛋白则通过结合到Ethylene Response Factors（ERFs）基因的启动子区，调控后者的表达，最终启动植物体对乙烯信号的应答响应[17]。此外，乙烯信号转导途径还涉及到了磷酸化级联反应、转录反馈调节以及蛋白和mRNA的降解调控等一系列的调控机制[15，18]。

在生产实践和新品种试种过程中发现，不同菠萝品种对乙烯利催花的敏感度存在较大差异，有些品种如‘Moris、‘Josapine和‘台农18对乙烯敏感，易催花；而卡因类的‘Sawarak和‘Mosapine对乙烯不敏感，催花难[19]。张治礼等[1]研究发现‘巴厘和‘台农4品种对乙烯敏感的范围较大，而低浓度的乙烯则无法诱导‘台农11、‘台农16和‘台农17开花。因此，本研究以乙烯敏感型的‘巴厘菠萝品种和乙烯钝感型的‘台农16菠萝品种为试材，通过比较乙烯信号转导途径中乙烯受体、信号转导和核内调控基因表达特征的变化，初步揭示造成2种类型菠萝品种对乙烯敏感差异的发生环节，为进一步阐明乙烯促进菠萝成花的机制及利用基因工程手段开展菠萝新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用‘巴厘和‘台农16两个菠萝品种作为试材，于2017年6月份在广东省湛江市南亚热带作物研究所科研示范基地进行。每个品种选取300株健康菠萝植株，均分为3个小区，每个小区100株菠萝植株，当生长期达到16个月，单株成熟叶片达到35片时，使用800 mg/L乙烯利（40%水剂）灌心，催花。分别在催花后0、1、2、4 d及1、2、4 w时，随机剥取每个小区10株处理的植株顶芽，于液氮速冻后放于-80 ℃保存，用作后续实验分析。每个小区采样后各剩余的30株植株正常管理，用于成花效应统计。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA第1链合成 总RNA提取使用北京华越洋生物科技有限公司针对多糖多酚植物的Quick RNA isolation Kit，具体方法参照说明书。总RNA提取后，分别用琼脂糖凝胶电泳和紫外核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度和纯度。然后每个样品取2.0 mg总RNA，用Thermo Fisher公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA第一链，具体操作均按试剂盒说明书进行。

1.2.2 乙烯合成途径相关基因的RT-qPCR分析 参照Real-time PCR引物设计的一般原则，使用Primer Primer 5.0軟件设计乙烯合成途径相关基因的Real-time PCR引物，委托天一辉远基因科技有限公司（广州）合成（表1）。Real-Time PCR反应使用Roche公司的Light Cycler? 480I system完成，试剂采用Applied Biosystems公司的Power SYBR Green PCR Master Mix。反应总体积为20 mL：10 mL 2×SYBR qPCR Mix，上、下游引物各1 mL（0.5 mmol/L），1 mL cDNA模板（约50 ng）和7 mL灭菌双蒸水。PCR反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；40个循环：95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s。随后进行65～95 ℃熔解曲线分析，鉴定扩增产物的特异性。使用Actin作为内参基因[20]，每个样品设3次重复。

1.2.3 mRNA相对表达量分析 运用2—△△CT法[21]计算AcFT等成花基因及AcERS1a等乙烯信号转导途径相关基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 ‘巴厘和‘台农16号乙烯利处理后的成花表现及成花基因表达规律

乙烯利处理后‘巴厘菠萝的成花率高达98.8%，而‘台农16菠萝的成花率则仅为76.7%，显著低于‘巴厘品种（表2）。

从图1-A可以看出，‘巴厘菠萝顶芽中AcFT的表达量在乙烯利催花4 d后开始迅速增加并保持

持续上升，至处理后4 w时达到最高值；而‘台农16菠萝顶芽中AcFT的表达量也是在乙烯利催花4 d后开始增加，处理2 w达到最高水平，随后逐渐下降。‘巴厘菠萝顶芽中AcFT的表达量从4 d时起极显著的高于‘台农16。‘巴厘顶芽中AcAP1的表达规律与AcFT基因类似（图1-B），也是在乙烯利处理4 d后逐渐增加，约4 w时达到最高值；而‘台农16顶芽中AcAP1的表达量在乙烯利催花4 d后开始增加，2 w后达到最高值，随后有所下降，但其整体表达水平明显低于‘巴厘品种（图1-B）。

2.2 ‘巴厘和‘台农16号乙烯利催花后乙烯受体基因的表达变化

通过对AcERS1a等乙烯受体的表达分析发现：‘台农16顶芽中AcERS1a的表达量在乙烯利催花1 d后达到最高值，然后持续下降急剧下降2 d时达到最低水平，随后又有所回升并保持在一个稳定水平。而‘巴厘顶芽中AcERS1a的表达则无明显变化，且整体水平显著地低于‘台农16（图2-A）；乙烯催花后，‘巴厘和‘台农16顶芽中AcERS1b表达量均迅速增加，并在处理后1 d时达到最高水平，随后逐渐下降，处理4 w后降至最低水平，两者的变化规律极为相似（图2-B）；

‘台农16顶芽中AcETR2a的表达量在乙烯利催花1 d后达到最高值，且极显著的高于‘巴厘品种，随后急剧下降2 d时达到最低水平，然后又稍微上升保持相对稳定的表达水平。而‘巴厘顶芽中AcETR2a的表达则相对较为平稳，变化幅度不大（图2-C）；‘台农16顶芽中AcETR2b的表达量在乙烯处理1 d后迅速增加，极显著的高于‘巴厘品种，随后急剧下降然后维持在一个较低水平，而‘巴厘顶芽中AcETR2b的表达与‘台农16类似，但变化幅度较小（图2-D）。

2.3 ‘巴厘和‘台农16号乙烯利处理后乙烯信号传导基因的表达特征

从图3可知，乙烯利催花后AcCTR1的表达量在‘台农16中呈现持续下降的趋势，而‘巴厘顶芽中AcCTR1的表达则是在处理后1 d时达到最高值，随后又下降，且整体表达水平显著地低于‘台农16（图3-A）；‘巴厘和‘台农16顶芽中AcEIN2的表达变化规律较为相似，乙烯处理1 d后迅速增加，随后下降然后维持在一个较低水平，但整体表达水平‘巴厘显著地高于‘台农16（图3-B）。

2.4 ‘巴厘和‘台农16号乙烯利催花后乙烯核内调控基因的表达差异

从图4-A的结果可以看出，‘巴厘和‘台农16顶芽中AcEIN3的表达均在乙烯处理1 d后迅速增加，‘巴厘的AcEIN3表达量随后下降至4 d时达到最低点后又逐渐上升。AcERF1和AcERF3在乙烯利处理后的表达规律相似，均是在‘巴厘品种乙烯利处理后1 d时达到表达高峰，而在‘台农16品种中呈现缓慢下降的趋势（图4-B～C）；且两个基因在‘巴厘品种中的表达量显著地高于同时期的‘台农16。AcERF11则表现出与其它两个ERF基因完全相反的规律，‘台农16中AcERF11的表达量在乙烯利催花处理后急剧下降，在2 d时达到最低点，随后又逐渐上升，而‘巴厘品种则无明显的变化（图4-D）。

3 讨论

3.1 乙烯利处理后2个菠萝品种的成花差异

植物FLOWERING LOCUS T （FT）同源基因在决定植物成花调控上起着关键作用[22-24]，APETALA1（AP1）在植物花器官形态建成中起着重要作用[25-26]，菠萝花芽诱导期是其生長发育的关键时期，是一个复杂的形态建成过程，与其果实品质和产量密切相关[27]。在菠萝自然成花具有极大不确定性的前提下，其人工调控菠萝成花已成为国内外菠萝研究者和种植者重点关注的研究领域之一。目前，许多专家学者已针对不同品种，不同种植条件和不同施用方法，对外源刺激诱导菠萝成花进行了系列研究，确认了乙烯是目前唯一被证实能够直接启动菠萝生殖生长的激素[5]，并发现乙烯利诱导菠萝开花是通过诱导内源乙烯的生物合成发挥作用，菠萝的成花还会受到植株重量、品种类型、环境条件等其它因素的影响[27-28]。近年，菠萝新品种引进及推广工作也备受关注，但新品种（如台农系列）试种及推广中发现菠萝不同品种间对乙烯利诱花的敏感度存在较大差异。一些品种如‘台农13、‘台农16和‘台农17等对乙烯的敏感性较差，不易催花，属乙烯钝感型品种；而‘巴厘和‘Perola 等品种易受乙烯诱导开花，属乙烯敏感型品种[1]。本研究结果也验证了这一结论：乙烯敏感型菠萝品种‘巴厘催花后成花率达到了98.8%，而乙烯钝感型菠萝品种‘台农16乙烯催花率只有76.7%，相同浓度的乙烯利诱导后，‘巴厘品种的成花率显著地高于‘台农16。从成花关键基因FT及花器官形态建成重要基因AP1的表达量来看，‘巴厘顶芽中AcFT和AcAP1的表达量均明显高于‘台农16，说明了乙烯敏感型菠萝品种对相同浓度的乙烯利处理后成花响应更加强烈，成花表现更为明显。

3.2 乙烯利处理后乙烯受体相关基因的表达差异

乙烯与植物的生长发育和胁迫应答有密切关系，参与植物种子萌发、花器官形成、果实发育和成熟、根伸长、叶和花的衰老等植物发育过程的调控[16]。在拟南芥等模式植物建立的整个乙烯信号转导途径为：C2H2→ETR1/ERS1/EIN4/ETR2/ERS2 →CTR1→EIN2→EIN3/ERFs→乙烯生物学效应[29]，但在凤梨科植物中乙烯诱导其开花的机理目前尚不清楚。乙烯受体是乙烯的信号感知元件，Li等[20]在乙烯敏感型‘Perola菠萝中共发现4个感知乙烯信号的受体AcERS1a、AcERS1b、AcETR2a和AcETR2b，其荧光定量PCR结果表明，与AcERS1a和AcERS1b相比，AcETR2a 和AcETR2b对乙烯利处理更敏感；乙烯利处理后早期尤其是处理后1～2 d时，AcERS1b、AcETR2a 和AcETR2b有一个表达高峰，相比较而言AcERS1a的相对表达量变化较小。从本研究的结果可以看出，2个品种中AcERS1b和AcETR2b的表达规律类似，均在乙烯利催花后1 d左右迅速增加，随后逐渐降低，与Li等[20]的结果一致。而AcERS1a和AcETR2a的表达量则在乙烯钝感型菠萝品种‘台农16顶芽中的表达量明显高于乙烯敏感型‘巴厘品种。‘台农16中AcERS1a和AcETR2a也是乙烯处理后1 d左右出现表达高峰，且极显著的高于‘巴厘品种。与Li等[20]的结果不一致的是，AcERS1a和AcETR2a在同为乙烯敏感型的‘巴厘品种中表达无明显变化，这可能因为所用的品种或者植株状态及处理季节等不同所导致的。最近研究表明，不同乙烯受体成员在不同生物学过程中起不同的作用[30-33]，在西红柿中，只有某些特定的乙烯受体调节果实的成熟，但是其它受体在这一生物学过程基本上没有什么作用[31]；在拟南芥中，ETR1与ETR2基因在盐胁迫下的种子萌发过程中起着相反的功能[33]。本研究结果表明：AcERS1b和AcETR2b可能在乙烯诱导两种菠萝成花中起着重要的作用，而AcERS1a、AcETR2a和AcETR2b则很可能是两个品种菠萝产生成花差异的主要原因。

3.3 乙烯利处理后乙烯信号传导及核内调控基因的表达差异

乙烯受体蛋白结合乙烯后抑制了Raf-like Ser/Thr蛋白酶对CTR1的磷酸化能力，使得膜蛋白EIN2被激活[11-12]。作为乙烯信号转导途径中的重要基因，CTR1和 ENI2分别协同负调控和正调控乙烯反应[15]。从本实验2个品种AcCTR1和AcENI2的表达特征来看，乙烯催花后‘巴厘顶芽中AcCTR1的表达量逐渐下降，‘台农16顶芽中AcCTR1的表达量催花后1 d左右略微增加，隨后也逐渐下降。乙烯敏感型菠萝品种‘巴厘顶芽中AcCTR1表达量极显著地低于乙烯钝感型菠萝品种‘台农16，这表明CTR1在负调控菠萝响应乙烯反应中可能起着重要作用。而‘巴厘AcENI2的表达量明显高于‘台农16，这说明相比于乙烯钝感型菠萝品种‘台农16，乙烯利更容易激活乙烯敏感型菠萝品种‘巴厘的膜蛋白AcENI2。综上，AcCTR1和AcENI2在2个类型品种中的表达差异可能是其对乙烯敏感度差异的主要因素之一。

核内调控基因EIN3/EIL和ERF依次位于CTR1下游，正调控乙烯反应[15]。在‘蜻蜓凤梨的研究已证明EIN3受乙烯信号诱导，可能在乙烯诱导凤梨开花中起重要作用[34-35]。乙烯处理后，在成花的‘蜻蜓凤梨中，AfEIN3的表达量在1 h即达到峰值，然后逐渐下降。我们本研究的结果中两个菠萝品种均在乙烯利处理后1 d时AcEIN3表达达到峰值，这与‘蜻蜓凤梨出现高峰的时间存在一定差异，可能是由于物种不同所致。处理前期，乙烯敏感型菠萝品种‘巴厘顶芽中AcEIN3表达量要显著地高于乙烯钝感型菠萝品种‘台农16，2个品种间AcEIN3的表达差异也可能是导致其对乙烯敏感性差异的重要原因之一。EIN3蛋白通过结合到ERFs的启动子上来调控后者的表达，最终启动乙烯的应答响应[15]。ERFs基因编码的是一类家族蛋白，这类蛋白属于APETALA2 /Ethylene Response Element Binding Protein（简称AP2 /EREBP）家族。ERFs基因家族在拟南芥等植物中已被大量研究[36-39]，但在菠萝中尚未见详细的报道，仅在凤梨科植物‘蜻蜓凤梨中有少量报道。雷明等[40-43]在‘蜻蜓凤梨中已经克隆出3个ERF家族基因，并证明其响应了外源乙烯调控，且表达量在外源乙烯处理后呈现正调控趋势。本研究结果表明：在乙烯敏感型菠萝品种‘巴厘中，AcERF1和AcERF3受外源乙烯的正调控，在乙烯利处理后1 d时有个表达高峰，这与‘蜻蜓凤梨的实验结果类似；但这2个基因则在‘台农16品种中呈现缓慢下降的趋势，这可能是导致两个品种对乙烯信号差异响应的另一个重要原因。AcERF11则表现出与其它2个ERF基因完全相反的规律，说明ERF家族基因不同成员在乙烯诱导菠萝成花中可能起着不同的作用。

综上所述，本研究通过对乙烯敏感型的‘巴厘菠萝品种和乙烯钝感型的‘台农16菠萝品种催花后菠萝品种间的成花效应、ERS1a和 CTR1乙烯信号转导相关基因及FT和AP1等重要成花基因的表达特征差异分析发现：ERS1b、AcETR2a、AcETR2b、AcCTR1、AcENI2、AcEIN3、AcERF1和AcERF3等基因在2种成花类型中的差异可能是导致不同品种对乙烯信号感知敏感度不同和成花效应差异的重要原因；ERS1b、ETR2a和ETR2b等乙烯受体可能参与乙烯诱导菠萝成花信号的感知，然后通过CTR1和 ENI2将信号转导至核内调控基因（EIN3、ERF和ERF3），从而启动菠萝成花关键基因FT和花器官形态建成重要基因AP1的表达，从而引起菠萝成花的生物学效应。这些结论将为乙烯诱导菠萝成花分子机制的阐明提供重要参考和研究思路。

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