金永浩

摘 要：这项实验是通过液体静止的方式来培养、观察研究牛樟芝（Antrodia camphorata）在不同的时间段内、在不同的温度、不同湿度、不同浓度的碳氮源和不同营养成分的培养基中激发子红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicoLa（Swartz.：Fr.）Karst.）对牛樟芝之中的菌丝体中的总三萜的数量和质量的影响。通过此项实验，筛选出牛樟芝较为适合生长的培养基中各项元素的含量。具体的测量方法为紫外分光光度法，用紫外分光光度计测量，并绘制制作标准曲线，来测定其吸光度的大小，并通过这个数值，来计算出总三萜的重量。实验表明：牛樟芝的菌丝体在优化培养基中达到了最高的产量，其数值达到了3.31克；而在另一种GPY的培养基中产量则截然不同，在此培养基中，产量仅有0.45克。根据实验得，在其他三种培养基中，牛樟芝菌丝体的产量都在3.0克左右徘徊，相差不大。在温度这项数据中，牛樟芝在26℃时的产量达到了最大值，牛樟芝在26℃呈正态分布，离26℃越远则产量越低，当温度高于35℃时，则不能存活。在长达30天的培养周期中，gpy的总三萜产量所占比最大，高达3.8%其他培养基则无明显的变化。由此得出结果：牛樟芝在不同的培养基中所产出的总三萜和菌丝体都不同。其中在牛樟芝长势最好的培养基环境成分为：葡萄糖、胰蛋白酶、五水硫酸镁、氯化钾，酵母浸粉。最适合的温度为26℃，最适合的培养周期为25天。另外还发现，红缘拟层孔菌似是催化剂一般，无论是对总三萜还是菌丝体都有促进作用。

关键词：总三萜；菌丝体；牛樟芝；红缘拟层孔菌

1 绪论

牛樟芝，又称之为阴阳菇。自打20世纪末期以来才被人们在中国台湾发现。牛樟芝含有多种微量元素，迄今为止，人们从牛樟芝中成功分离并且发现了两百多种微量元素，这些元素的种类很多，有大分子化合物，如多糖、蛋白质等。还有小分子化合物，如各种芳香烃等，还有少量的微量元素。这些化合物对于治病的治疗起到了绝佳的治疗效果，相传有起死回生的妙用。在人们的生活中更是可以加血人体的血液循环和新陈代谢，可以抵抗癌细胞的扩散，抑制血小板的凝结，降低血脂等众多医学作用。

自打这种药材被发现至今，牛樟芝作为顶尖的药引一直被医学界所推崇。牛樟芝对生长条件的要求也极为苛刻，只有在牛樟树上可以生长。相传在早在18世纪，高山一族就用牛樟芝作为药引，治病救人。但是牛樟芝由于其生长环境太为苛刻，必须生长在牛樟树上，而牛樟树也只能生长在牛樟木的阴面。牛樟木本身生长就极为困难，加上近些年来一些木头贩子对牛樟木的乱砍乱伐。使得牛樟木急剧减少，牛樟树也随之减少，牛樟芝被剥夺了生存环境，产量也持续下跌。

1.1实验试剂和仪器

实验试剂的选择也是多样的，比如说蔗糖，果糖，淀粉，乳糖，麦芽糖，葡萄糖等多糖试剂，还有甘油，木糖醇，牛肉蛋白胨，胰蛋白胨等。此外还有无水硫酸镁，磷酸氢二钾，硝酸钠，高氯酸和次氯酸等化合物，还有各种醇类、醛类和芳香烃类。

实验仪器为标准的又赛默飞世尔科技公司提供的紫外可见光光度计，MTFG-A型号的通风柜，中国昆山禾创超声仪器公司提供的超声波清洗仪器。另外还有标准制式的移液枪、烧杯、量筒、离心管、玻璃棒、小镊子等实验室用品。大型仪器还有海精宏实验设备有限公司出产的电热恒温鼓风干燥箱、和型号为DNP-9052的电热恒温培养箱，上海宜昌仪器纱筛厂所产的HHS-2型电子恒温不锈钢水浴锅，上海越平科学仪器有限公司出产的YP5002型号的电子天平。此外还有美国MiLipore公司的建立的超纯水系统，和苏净集团安泰公司的超净工作台。

1.2培养基的选择

培养基的选择主要有五种，他们分别是优化培养基、PDA加富培养基、原生态PDA培养基、GPY培养基和常用的胡萝卜培养基。其中优化培养基的成分为：ph为7，无水硫酸镁每升1.45克，磷酸二氢钾每升0.736克，胰蛋白胨每升14.2克，酵母浸粉每升10克，葡萄糖每升20克。

PDA加富培养基的成分为ph为7，葡萄糖每升20克，磷酸二氢钾每升1克，土豆每升200克。

而PDA培养基ph为7，葡萄糖每升20克，土豆每升200克，比PDA加富培养基少了营养物质。

GPY培养基ph为7酵母膏为每升10g，蛋白胨为每升6g，葡萄糖为每升20克。

胡萝卜培养基ph值为7，葡萄糖每升10克，胡萝卜每升100克。

1.3培养方法

在进行实验之前，要对所要培养的菌种进行活化。具体步骤为：首先把菌种从冰箱中取出来，第二步为将冷藏的材料恢复到室温。第三步为采用无菌操作的方法将室温的菌种接种到五种不同的培养基上。第四部为，挑选临时培养基上成长状况较好的菌落，将其接种到新的培养基中，如此重复3次，得到生长状况较好的培养基。最后把其接种到恒温的培养箱中，保持26℃条件不变，成长周期为21天，并定期观察三萜化合物和菌丝体的重量变化情况。

1.4牛樟芝利用温度实验

在进行变量为温度的实验时，在对培养基进行优化的基础上，调整不同的温度，将其分成6组，分别置入35度、30度、28度、26度、20度、15度的培养箱中，培养周期为21天，并且定期观察三萜化合物和菌丝体的重量变化情况

1.5牛樟芝利用时间实验

在进行变量为时间的实验时，在对培养基进行优化的基础上，培养周期为21天，并且定期观察三萜化合物和菌丝体的重量变化情况

1.6牛樟芝利用红缘拟层孔菌实验

在进行变量为红缘拟层孔菌的实验时，在对培养基进行优化的基础上，将实验分为四组，第一组接种被灭活杀死失去活性的红缘拟层孔菌，之后的每组实验分别接种尚有活性的红缘拟层孔菌、尚有活性的红缘拟层孔菌和被灭活杀死失去活性的红缘拟层孔菌的混合物。第四组则什么都不加，还用牛樟芝的原液，且每组实验的接种量均为0.3毫升，培养周期为21天，并且定期观察三萜化合物和菌丝体的重量变化情况

1.7牛樟芝菌丝体总三帖产量的测定

当以上的实验变量都经过测量后，温度、时间、不同培养基，是否接种红缘拟层孔菌或者是牛樟芝原液等变量条件都一一测量后。在培养一个周期后，将培养基倒入网筛，并加以筛选，具体的方法是用吸水性的滤纸，充分的把培養基中的水分吸干。而后将其倒入容器并做好标识放入干燥箱之中进行干燥，干燥箱的温度应控制在70度左右，将水分完全蒸发后，对三萜化合物和菌丝体进行称重测量。

而对于样品溶液则要有不同的处理方式，菌丝体虽然产前千差万别，但是所取的数量却少之又少。所以通常用移液枪取大约0.3克，置于50毫升的容量瓶中，并用乙醇进行稀释、定容，将其总数定在30毫升处。将超声波调至30khz，进行超声提取操作，持续两小时，在整个操作过程中不得使用手晃动。等到结束后，放到试验台上等其自身沉降十小时，最后取上清液备用。

标准溶液的处理则较为简单，称取10毫克的齐墩果酸，采用甲醇将其稀释、定容到30毫升。

在实验过程中，沸水在蒸干时，由于存在水蒸气的液化现象，由此会对实验产生些许干扰，因此需要干燥箱来处理水蒸气。待实验完成后，取出试管，将试管迅速冷却（冷却方法为放入冰水混合物中），待冷却完成后，加入5毫升乙酸，搅拌试管，使其混合充分。用紫外可见光光度计来测定其不同部位的吸光度，并记录数据，以此来计算总三萜的质量。

在实验完成后，要对实验数据进行处理，绘制标准曲线。标准取消要以熊果酸的质量为纵坐标，吸光度则作为纵坐标，标点，描绘曲线，根据曲线来计算总三萜质量。

参考文献

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