李娇娇 田启威 杨仕平

摘要：

体内金属离子的检测常采用磁共振成像（MRI）.MRI灵敏度较低，需要造影剂来提高检测的精确度.目前临床上用的造影剂主要是Gd3+螯合物.综述了基于Gd3+造影剂的生物体内金属离子检测的研究进展.

关键词：

磁共振成像（MRI）; 造影剂; Gd3+; 生物传感器

中图分类号： O 614.24文献标志码： A文章编号： 1000-5137（2018）01-0090-10

Advances in application of Gd3+ contrast agent for

in vivo detection of metal ions

Li Jiaojiao， Tian Qiwei*， Yang Shiping*

（College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：

In the life system，metal ions are the important elements for tissue growth and development.The content of the metal ions is closely related to the balance of the internal environment.If the in vivo concentrations of metal ions are out of balance，it will be easy to cause diseases.Therefore，it is very important to assess and understand the concentration changes of in vivo metal ions for the diagnosis of diseases.Due to its deep tissue penetration，high spatial resolution，no damage，no invasion，and ability to track three-dimensional dynamic imaging，MRI is widely used for the detection of the in vivo metal ions.Normally，MRI contrasts are required to improve the accuracy of metal ion detection by reason of the low sensitivity of MRI.At present，the contrast agents used in the clinical detection of in vivo ions are mainly Gd3+ chelates.Thus，we will introduce the recent advances of Gd3+ contrast agents for in vivo detection of metal ions in this review.

Key words：

magnetic resonance imaging（MRI）; contrast agent; Gd3+; biosensor

收稿日期： 2017-09-13

基金項目： 国家自然科学基金（21601124，21671135）

作者简介： 李娇娇（1992-），硕士研究生，主要从事纳米材料在MRI造影剂方面的研究.E-mail：1079928543@qq.com

*通信作者： 田启威（1983-），男，博士，副教授，主要从事生物材料的开发和应用方面的研究.E-mail：qiweitian@shnu.edu.cn;杨仕平（1969-），男，博士，教授，主要从事MRI造影剂的开发及其应用方面的研究.E-mail：shipingy@shnu.edu.cn

引用格式： 李娇娇，田启威，杨仕平.Gd3+造影剂在体内金属离子检测中的应用研究进展 [J].上海师范大学学报（自然科学版），2018，47（1）：90-99.

Citation format： Li J J，Tian Q W，Yang S P，et al.Advances in application of Gd3+ contrast agent for in vivo detection of metal ions [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2018，47（1）：90-99.

0引言

金属离子在有机体的生长和发育过程中起着重要作用[1].它主要以辅助因子的形式存在于多种生物活性酶中，尤其在神经系统的调节中具有很大的作用[2].体内金属离子浓度失衡易导致各种疾病，如：心脏病、癌症、糖尿病及神经退行性疾病等[3-5]，因此，理解和掌握各种金属离子在生物体内的浓度分布具有重要的意义.实时、无损检测各种金属离子的浓度是研究中的一大难点[6].分子影像技术可用于检测金属离子浓度，为疾病的诊断提供了良好的手段[7].

核磁共振成像（MRI）可检测人体内氢核的纵向弛豫时间（T1）和横向弛豫时间（T2），主要应用于生物医学诊断，具有穿透性强、空间分辨率高、无损伤、无辐射、无侵害性，且能够追踪三维动态成像等诸多优点[8]，使医疗诊断变得更方便、更有效.然而，临床中其灵敏度相对较低，无法准确区分一些正常生理组织和病变组织[9]，因此需要借助静脉注射或口服药物，即造影剂（CAs）来增强正常组织与病变部位的对比度[10].含钆（Gd3+）的顺磁性金属配位化合物[11]常用于T1磁共振成像造影剂，但由于毒性较大，临床上常用其螯合物.Gd3+具有7个未成对电子，填充在f轨道上[11]，使其具有较高的磁距和对称的电子基态（8S7/2），由于其未成对电子活性较强，能够影响周围的核，从而改变弛豫时间.

在Gd3+螯合物的基础上，连接不同配体.配体对金属离子有更强的亲和力和选择性，故在加入金属离子后，配体优先与其结合，使Gd3+中心配位点空出，从而增加内层水分子的数量，提高水的配位数，改变弛豫度.内层水分子的数量通过测量镧系元素的荧光寿命确定，Tb3+和Eu3+是常用的两种元素，当其4f层电子从高能级回迁至低能级时，会以可见光的形式释放能量[12].

本文作者综述了基于Gd3+螯合物的金属响应性MRI造影剂，应用于生物体内钙、铜、铁、锌离子检测的进展.

1磁共振成像原理

磁共振现象是原子核的核物理特征，是MRI的基本原理之一，人体内含有大量的质子，而人体内水的质量占人体质量的70%，故选择氢核作为成像核[13].MRI造影剂通过改变组织中氢核的局部磁环境，间接影响其弛豫特性来改变信号强度[14]，在垂直于外磁场的方向施加角频率与质子拉莫尔频率相等的射频电磁波，质子能够吸收能量并被激发到反平衡态，产生核磁共振现象.射频消失后，处于激发态的质子群系统恢复到原来的平衡状态，即弛豫过程，包含分别沿纵向磁化矢量和横向磁化矢量恢复的两个分过程，分别称为T1弛豫（自旋-晶格弛豫，即自旋原子核把从射频脉冲处吸收的能量通过晶格的形式扩散出去，实现自身能量释放）和T2弛豫（自旋-自旋弛豫，即自旋核与另一个自旋核进行能量交换的过程[15]）：

M0（t）=M0（1-e-tT1），（1）

Mxy（t）=Mxye-tT2，（2）

式（1）中M0是射频脉冲作用前质子系统的纵向磁化强度矢量的大小，T1为纵向弛豫时间，即由零恢复至M0的63%所需时间;式（2）中Mxy是射频脉冲过后初始磁化强度矢量在横向的最大值，T2为横向弛豫时间，即从最大值衰减至最大值的37%所需时间[16].MRI的信号强度（Is）本质上取决于质子密度和质子的弛豫时间，遵循以下公式[17]：

Is（TE，TR）≈AN（H）1-e-TRT1e-TET2，（3）

式中N为氢核（H）的质子密度，A为增益，TR和TE分别为重复时间和回波时间.由式（3）可知，T1越短，信号强度越强，表现为图像越亮;T2越短，信号强度越弱，表现为图像越暗.通过选择合适的TR，TE，改变质子密度以及T1，T2值来影响其信号值，进而影响其成像权重[18].

2造影剂的成像原理及影响因素

MRI造影剂同时影响T1，T2值，但影响程度不一样，在一定浓度范围内，有一个起主导作用，据此将造影剂划分为T1型和T2型两种类型;T1造影剂增加信号强度，使图像变亮;T2造影剂降低信号强度，使图像变暗[19].通过测定弛豫度Ri=1/Ti （i=1，2） 来判定其图像对比度，ri为造影剂的造影效率，ri=Ri/c，c为造影剂的离子浓度，r2/r1可用于区别材料是T1造影剂还是T2造影剂.若比值为1～2，则材料为T1造影剂;若比值大于10，则为T2造影剂[16].

根据“双层配位”的模型[20]描述T1造影剂影响弛豫时间的过程，如图1所示.图1（a）中包括与核Gd3+直接配位的内层水，和配体分子有配位作用或者受到影响的外层水，以及最外层的自由水.

影响造影剂弛豫度的因素有很多：采用Solomon-Bloembergen-Morgan公式[21]描述：

1TIS1=qpm/（T1m+τm），（4）

1TIS2=PmτmT-22m+τ-1mT-12m+ΔW2mτm（τ-1m+T-12m）+ΔW2m，（5）

1T1m=215rI2g2μ2BS（S+1）r6GdH7τc21+w2sτ2c2+3τc11+w2Hτ2c1+23S（S+1）Ah2τe1+w2sτ2c，（6）

式（4）中1TIS1和1TIS2分别是大量自由水分子的纵向和横向弛豫时间，q为配位水分子数，pm是水分子与Gd3+配位的摩尔分数，1/T1m，2/T2m分别为结合水分子的纵向与横向弛豫时间，τm为水分子与Gd3+的配位时间;式（5）中，Δwm为自由水分子与结合水分子化学位移差异;式（6）中，rI是質子螺旋磁比，b是波尔磁子，rGdH为Gd3+与配位水的氢核的距离，A/h为标量耦合常数，τc，τe分别是耦极-耦极间的相关弛豫和标量弛豫度，w1，ws分别代表核和电子的拉莫尔进动频率，S代表总电子自旋时间.τR为整个造影剂分子在水溶液中的翻转时间.

由式（4）～（6）可知，通过设计造影剂分子，优化参数，可以大幅提高其弛豫度，如图1所示.

1）增加与Gd3+配位的内层水分子数q，Gd3+是9配位离子，通常需要8～9个齿配体才能稳定结合，在保证其稳定性的前提下尽可能增加配位分子数;

2）延长配合物的翻转时间τR，其与分子大小、结构刚性关系密切.结构刚性越大，τR值越大，对应的弛豫度越大.主要有两种改变其刚性的方式：① 诱导多个Gd3+聚合;② 通过裂解，降低分子量;③ 形成多个以Gd3+为中心的结构;④ 提高配位水分子的交换速率.

图1基于Gd3+分子造影剂的作用原理[20]及对其弛豫度的影响因素[22].（a） 控制Gd3+弛豫度

参数的示意图;（b） 配位水分子数q的变化;（c） 旋转相关时间τR的变化通过，

i） 诱导多个Gd3+的聚集，ii） 切割来减小分子量;（d） 使用带有多个Gd3+中心的系统

3金属响应的磁共振造影剂的设计原则

设计金属离子响应型MRI造影剂，应遵循以下原则[23-24]：1）选择性：在不同阴离子、有机小分子、高分子存在的情况下，金属离子能够对其有选择性，因为生物体内的金属离子种类繁多，浓度达到毫摩尔级的主要有：Na+、K+、Mg2+和Ca2+.MRI传感器必须要对特定离子进行响应[25]，只有这样才可避免错误信号的产生，同时也可避免信号被阳离子所覆盖，选择性主要是由造影剂的响应配体所控制;2）高弛豫性：可以减少成像造影剂的用量，提高对比强度;3）MRI探针必须与生物体相容[1]，水溶性好，低毒性，在人体内有适当的滞留时间.

4基于磁共振成像造影剂在离子检测上的应用

4.1基于Gd3+造影剂对Ca2+的检测

人体内Ca2+的平均含量约为1 kg，主要以矿物质的形式存在于骨骼中，有1%（质量分数）的Ca2+参与血液循环过程[26-27]，Ca2+是中枢神经系统电活动的基本传感器，其进入细胞质负责动作电位的产生和传播，并通过神经递质的释放引发神经元间的通信并且可以激活基因的表达[26].在不同刺激下，Ca2+浓度波动范围较大（0.1～2×103 mol·L-1）[26]，因此，钙离子浓度的波动被认为是决定神经系统功能的一个重要因素.

Meade等[28] 研究出第一个针对Ca2+响应的基于Gd3+的造影剂：DOPTA-Gd，它是DO3A （1，4，7-三-（羧甲基）-1，4，7，10-四氮杂环十二烷）与BAPTA （1，2-双（邻氨基苯氧基）-乙烷-N，N-二硝基乙二胺四乙酸）螯合的产物，DO3A与镧系元素有较强的亲和力，BAPTA是Ca2+的选择性结合剂，亲和力极强.在没有Ca2+时，BAPTA的官能团与Gd3+中心结合，弛豫度r为3.26×103 L·mol-1·s-1.加入Ca2+后，BAPTA优先与Ca2+结合，则Gd3+的配位点空出，周围的水分子与Gd3+空出的配位点进行配位.原理如图2所示，通过配位结合，与水的配位数（q）增加，弛豫度r增加至5.76×103 L·mol-1·s-1.

图2Gd2+螯合物与Ca2+响应的原理示意图[29]

Gd-DOPTA可与Ca2+特异性结合[29]，通过测定弛豫度的变化，间接测定Ca2+的含量，但由于Gd-DOPTA针对Ca2+的敏感性较强，检测Ca2+的浓度范围较小（0.1～10 mol·L-1）.为解决此问题，Logothetis等[30]在Gd-DOPTA的基础上选择连接APTRA（邻氨基苯酚-N，N-乙酸三乙酯），APTRA与Ca2+有相对较弱的亲和力，此时Ca2+的检测浓度为20～25 mol·L-1.经过合成得到Gd-DOPTRA （Gd-DOPT-APTRA），弛豫度由原来的3.5×103 L·mol-1·s-1增加至6.9×103 L·mol-1·s-1.

虽然Gd-DOPTRA化合物比较稳定，但与大环配位体的乙酸酯链在体内分解较慢[31].基于此，Logothetis对Gd-DOPTRA进行探索，通过改变条件，获得一系列（Gd-DOPTRA（2-5））的化合物[29]，如图3所示;相对于Gd-DOPTA-1，Gd-DOPTA-2 的接连处由一个更短的碳链直接与芳香环连接.尽管Gd-DOPTA-2有较好的稳定性，但与Ca2+结合后弛豫度没有明显变化.Gd-DOPTA-3相对于Gd-DOPTA-2来说，多一个碳链，其不仅稳定性好，而且弛豫度增加了2倍（从没有Ca2+时的2.7×103 L·mol-1·s-1增加至Ca2+存在时的7.0×103 L·mol-1·s-1）.Gd-DOPTRA-4的结构类似于将酚醛树脂上的乙酸酯基转换成酰胺基;Gd-DOPTRA-5则是由延伸的醚链构成.在生物体的缓冲溶液中对两者的弛豫度进行测定，Gd-DOPTRA-4的弛豫度没有明显变化;Gd-DOPTRA-5的弛豫度在加入Ca2+之前和之后的值分别为2.6×103，5.9×103 L·mol-1·s-1，表现出良好的弛豫效能.

图3基于Gd-DOPTA的一系列配合物的结构式[29]

4.2基于Gd3+造影剂对Cu2+的检测

铜离子是参与生命代谢重要的金属离子，在各种生物过程中起着关键的作用[32-34]体内铜离子内环境失调会产生一系列的疾病，常见的神经性疾病主要有：阿尔兹海默症，威尔森氏症[34]，以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等疾病[35].评估和理解人体内铜离子的分布及含量是很有必要的[36].因此，针对Cu2+敏感的MRI造影剂有大量研究，针对近几年的研究进行概述.

Jong等[37]研究出对Cu2+具有响应能力的MRI造影剂──结构1，原理如图4（a）所示，相对其他金属离子来说，该化合物对Cu2+的选择性更好，并且通过在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的滴定实验，表明两者具有较强的结合能力.在相同实验条件下（pH=7.4，HEPES缓冲溶液，37 ℃），没有Cu2+时的弛豫度为2.01×103 L·mol-1·s-1，加入Cu2+后，结构1化合物中的配体优先与Cu2+配位，使Gd3+周围的内层水分子增加，与水配位数q增加，从而使弛豫度增加至4.01×103 L·mol-1·s-1（为原来的2倍）.

Xu等[38]设计并合成了以Gd3+为基础的双核造影剂[Gd2（DO3A）2BMPNA]，它是2个Gd-DO3A核与BMPNA（2，6-二（3-甲基-1H-吡唑-1-基）异烟酸）进行连接，BMPNA对Cu2+的响应远远高于其他金属离子，它是作为Cu2+诱导弛豫度变化的受体.没有Cu2+时的纵向弛豫度达到6.40×103 L·mol-1·s-1，加入Cu2+后，弛豫度增加至11.28×103 L·mol-1·s-1（增加了76%）.隨着Cu离子浓度的增加，弛豫度也逐渐增加，在浓度为0.6 mol/L，弛豫度达到最大值.原理如图4（b）所示：当Cu2+与化合物中心连接时，将Gd3+处的邻二氮杂茂中心的氮原子移除，由周边的水分子替代，使内层分子数增加，即与水配位数q增加，从而使弛豫度有所增加.

图4不同Gd3+螯合物与Cu2+响应的原理示意图.（a） 结构1与Cu2+响应的原理图[37];

（b） [Gd2（DO3A）2BMPNA]与Cu2+响应的原理图[38]

4.3基于Gd3+的造影剂对Fe2+/Fe3+的检测

铁元素是多种蛋白质的辅助因子，参与神经组织功能的调节，大量证据表明铁在大脑中的积累会导致中枢神经系统紊乱.但是，随着年龄的增长，铁在大脑中会逐渐积累，铁诱导的氧化应激反应可能会导致神经退行性疾病，例如阿尔兹海默症，帕金森等[39]，故检测人体内铁离子的含量变得尤其重要.

针对Fe3+的MRI造影剂，Aime等[40]报道了基于配体DTPA-双酰胺的化合物[DTPA（PAS）2]（Fe-85），以Gd3+和Fe3+为核形成稳定的杂双合金属配合物[（Gd-DTPA（PAS）2）]2Fe或[Gd-DTPA（PAS）2]3Fe（其取决于溶液的pH值），与化合物[Gd-DTPA（PAS）2]2-相比，弛豫度从4.6×103 L·mol-1·s-1增至5.7×103 L·mol-1·s-1;它是通过增加Gd3+周边的内层水分子的数量，从而使弛豫度增加.还有些常用的配体，如：水杨酸、儿茶酚;这些配合物在加入Fe3+后都有高弛豫度.三异羟肟酸钠配体[41]通过与Gd3+中心进行螯合，限制自由旋转，增加其刚性，弛豫度从5.4×103 L·mol-1·s-1增加至8.0×103 L·mol-1·s-1;弛豫度的变化表明高分子簇可降低分子旋转相关时间，在高磁场下产生高弛豫度.

已有关于Gd（（III）-Fe（II）的双核化合物作为MRI造影剂的报道，结构式如图5所示.根据两种核的不同络合能力和结构特点选择配体.Fe2+的配体有：三联吡啶[42]，邻二氮杂菲[43]和2，2′-联吡啶[44].另一方面，基于DTTA，DTPA，DOTA等配体常用于与Gd3+螯合，这些超分子化合物可以与Fe2+和Gd3+离子进行自组装.它们有较高的弛豫度，具有检测Fe2+的潜力.

图5Fe 配合物的结构式[1]

Merbach等[45]研究出[Fe（tpy-DTTA）2Gd2] （Fe-23），相对较低分子量的[GdH（TTAHA）]2-，有较高的弛豫度，（分别为17.4×103 L·mol-1·s-1和7.3×103 L·mol-1·s-1）.Fe-23的核心Fe2+（tpy）2是刚性结构，使得旋转相关时间变长，即τR增加，故弛豫度有所提高，但是稳定性有所下降.为解决此问题，该课题组又报道了一种基于双吡啶类的配体[46]，以双金属核Fe3+和Gd3+为基础的{Fe[Gd2bpy（DTTA）2]3}4-（Fe-24）结构，相对[Gd2bpy（DTTA）2]2-化合物来说，弛豫度较大，为20.17×103 L·mol-1·s-1.还有一种高分子四金属化合物[43] [Fe（Gd-DTPA-phen）3] （Fe-25），它由一个Fe2+离子与三个邻二氮菲分子结合，相对Gd-DTPA，Fe-25的弛豫度达至9.5×103 L·mol-1·s-1，有所提高.

4.4基于Gd3+的造影剂对Zn2+的检测

锌在生物体内主要以二价离子的形式存在，并且大部分与蛋白质结合，在基因转录和金属酶中发挥重要作用[35].Zn2+在哺乳动物的前列腺，胰腺和大脑中含量较高，Zn2+除了在大脑中可以调节神经传输之外，也与急性神经元的损伤有关，可抑制或诱导细胞凋亡.大量数据表明，Zn2+和其他金属离子（Fe2+/Fe3+和Cu+/Cu2+）是導致阿尔兹海默症的重要原因[20].Zn2+的含量缺失可能会导致前列腺炎和糖尿病.因此，检测Zn2+的含量对于理解糖尿病病因以及阿尔兹海默症的提前诊断具有重要意义.

针对Zn2+响应的MRI造影剂进行了大量研究，常见的有选择性螯合剂N，N-双（二-吡啶甲基）乙二胺（BPEN）可与二乙烯三胺五乙酸（DTPA）或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸（DOTA）或卟啉进行偶联[47]，从而形成针对Zn2+的传感器.Sherry等[48]发现Gd-DOTA-BPEN，结构如图6（a）所示，其未加入Zn2+之前，r1=5.0×103 L·mol-1·s-1;加入Zn2+后，在三羟甲基氨基缓冲液中对Zn2+响应，弛豫度增加至6.0×103 L·mol-1·s-1，故该配体对Zn2+有一定的选择性.经实验证明，该配体对Cu2+也可配位.在人血蛋白（HAS）中做相同滴定实验，其与HAS中的IIIA的二号位点结合，发现加入Zn2+之后弛豫度变化极大，由原来的6.6×103 L·mol-1·s-1增加至17.4×103 L·mol-1·s-1，增加165%.原理如图6（b）所示，Zn2+可与HAS结合降低其刚性，即τR降低，τR=（kex）-1（kex为水交换速率），水的交换率增加，从而使弛豫度增加.

图6（a） Gd-DOTA-BPEN的结构式;（b） Gd3+配合物与Zn2+作用的原理示意图[50]

Carlos等[49]报告二氮杂配体H5L，在Gd-DO3A的基础上合成获得GdL化合物，作为Zn2+响应的MRI造影剂，加入 Zn2+之后，弛豫度由原来的（3.08 ± 0.08）×103 L·mol-1·s-1，增加至（7.50 ± 0.08）×103 L·mol-1·s-1，为原来的150%.加入Zn2+后，Zn2+可与配体中的TACN结合，使Gd3+周围内层水分子与其配位，增加配位水分子数q，从而弛豫度有所增加.

5小结和展望

结合生物体内金属离子特异性与MRI造影剂，利用结合前后造影剂信号的变化，对金属离子进行定性和定量检测，为医学、药理学、生物化学等多种学科领域的金属离子检测提供了一种新方式.但仍有很多待解决的困难，如需要将MRI与其他分子影像技术，如光学、正电子发射断层成像以及电子计算机断层扫描等结合起来，通过多模态成像技术克服单一影像技术在定性和定量检测上的困难;另外生物体内复杂的化学环境，如细胞内外环境中存在高浓度的阴离子、有机物分子等，会对金属离子的检测有一定的干扰作用，因此需要设计具有更高选择性和特异性的造影剂.利用分子成像技术检测生物体内的金属离子含量在医学领域的应用将越来越广泛.

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