黄小玲　张登　廖嘉明

摘要实时荧光定量PCR技术，因其具有操作简单、重复性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点，已广泛应用于分子生物学研究的多个领域。对实时荧光定量PCR技术的原理、定量方法以及在植物研究中的应用等进行概述，以促进该技术的应用。

关键词实时荧光定量PCR；原理；应用

中图分类号S126文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0036-05

Principles and Applications of Fluorescent Quantitative PCR in Plant Research

HUANG Xiaoling， ZHANG Deng， LIAO Jiaming et al

（Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm， College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agriculture University， Guangzhou，Guangdong 510642）

AbstractRealtime fluorescence quantitative PCR technology has been widely used in many fields of molecular biology research due to its advantages of simple operation， good repeatability， high sensitivity， accurate quantitation and high speed. Principle，quantitative methods and applications in plant research of realtime fluorescence quantitative PCR technology were reviewed to promote its application.

Key wordsRealtime quantitative PCR；Principles；Application

自从1985年Saiki等[1]发明聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）以来，PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。但传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。直到1992年，日本Higuchi等[2]首次采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出荧光定量PCR技术的概念。当时他使用EB（溴化乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品，然后通过CCD相机检测产生的荧光值，利用PCR反应中的数学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到对检测样品进行准确定量的目的。但由于这种方法实验仪器昂贵，一些非特异的PCR产物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种试验技术在当时没能成为主流的试验技术。

1995年美国PE公司成功研制TaqMan技术，1996年又推出首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，荧光定量PCR才很快得到大家的接受，并广为应用。

1RT-qPCR技术的原理

实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）是通过对PCR扩增反应中每个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可分为3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。该技术不仅实现对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[3-6]。

2RT-qPCR的分类

荧光定量PCR使用的荧光化学可分为2种：荧光探针和荧光染料。而荧光定量PCR的方法相应的可分为特异类和非特异类2类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行，并且价格较低。

2.1SYBR Green Ⅰ

SYBR Green Ⅰ 是一種能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光大大增强。SYBR Green Ⅰ 的最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm。由于SYBR Green Ⅰ没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。但它能与所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需要特别定制不同的特异的探针，通用性较好，并且价格相对较低，因此国内外在科研中使用比较普遍。

2.2水解探针（Taqman）

Taqman探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭剂则在3末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。

2.3杂交探针（Beacon、FRET）

分子信标（molecular beacon）是一种呈发夹结构的颈环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的颈环结构中，环一般为15～30个核苷酸长，并与目标序列互补：颈一般为5～7个核苷酸长，并互相配对形成颈的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成颈环结构，当加热变性会互补配对的颈环双链解开，如果有模板存在，环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团有FAM和Texas Red。

FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由2条相邻探针组成，当退火时，在一条探针的5端标记FAM和在另一条探针的3端标记Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为640 nm的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640 nm波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非积累信号。常用的荧光基团有LC-Red640、LC-Red705。

3RT-qPCR的定量方法

在实时荧光PCR中，模板的定量有2种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。

3.1绝对定量

绝对定量RT-qPCR一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量。而标准样品的种类有含有与待测样品相同扩增片段的克隆质粒、含有与待测样品相同扩增片段的cDNA或PCR的产物。将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的ct值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的ct值，即可在标准曲线中定出样品的拷贝数。绝对定量具有稳定、准确等优点，因此在很多文献中已有报道[7-11]。

3.2相对定量

相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，采用靶基因与内源对照基因的表达比值来标准化结果[12-14]。在定量PCR中，为了去除不同样本在RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择内参基因进行校正和标准化[15-19]。定量PCR结果的准确性在很大程度上取决于稳定内参基因的选择。目前，Vandesompele等[20]、Andersen等[21]、Pfaff1等[22]分别编写GeNorm、NormFinder和BestKeeper程序用于比较内参基因的表达变化和稳定性，并且GeNorm程序得到进一步改进[23]。

4MIQE指导方针

目前，对如何更好地进行和解释定量PCR试验缺少一致的意见。且由于缺少足够的试验细节描述而进一步恶化，从而妨碍读者对试验结果的精密评价和试验的重复。因此，Bustin等[24]于2009年提出MIQE指导方针（The Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments，MIQE）。MIQE是一套评估定量PCR试验描述的最低需要的指导方针，包括样品的获取、试验设计验证以及数据分析等方面。MIQE指导方针旨在于为试验结果提供可靠性，从而确保科学文献的真实性、促进实验室之间的一致性以及提高试验的透明度。非定量PCR专业人士对于MIQE指导方针众多试验关联细节的详尽描述感到繁琐和畏惧，使得已建立的试验常规报告变得复杂。为此，Bustin等[25]于2010年提出一套简约版的指导方针——MIQE概要，覆盖每个定量PCR试验的主要参数。按照MIQE的指导方针，完全公布试验试剂、序列以及数据分析方法能更好地使其他研究者重现试验结果[24]。

安徽农业科学2018年

5实时荧光定量PCR在植物研究中的应用

定量RT-PCR技术主要用于基因表达的定性和定量检测，其自问世以来在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域取得较大的成绩[26]。雖然在植物研究方面应用起步较晚，但目前在植物学研究中的应用越来越广泛，如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测、信号转导、环境对植物基因表达的影响等方面[27]。

5.1基因差异表达分析

植物的生长、发育、分化和衰老涉及许多基因的时空顺序表达，因此，研究这个过程中基因表达的变化是揭示生长发育机理的重要手段。RT-qPCR技术是研究植物基因表达水平变化的一项重要技术[27]。Farzad等[28]利用RT-qPCR技术研究角堇（Viola cornuta cv.）的3个花青苷生物合成基因查尔酮合酶基因（CHS）、二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）和花色素合酶基因（ANS）在花的3个不同发育时期的表达差异，并且把角堇确立为研究自然条件下基因调控花颜色改变的新模式系统。Harada等[29]在康乃馨开花的过程中，研究与花瓣的生长和发育相关基因的表达，荧光定量分析显示4个木葡聚糖内传糖苷酶/水解酶基因XTH（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）和3个扩展蛋白基因EXP（expansin，EXP）在康乃馨的绿色营养器官、花瓣、柱头以及花柱的不同部位存在差异表达，并且发现在不同的发育时期，这7个基因在花瓣中的表达也有差异。结果表明DcXTH2、DcXTH3、DcEXPA1和DcEXPA2在康乃馨花开放的过程中与花瓣的生长发育有关。Wang等[30]利用荧光定量PCR研究EXP基因在杉木各个不同部位的表达情况，发现ClEXPA1、ClEXPA2 2个基因在形成层中存在特异表达，并结合转基因烟草研究，表明这2个基因通过直接或间接影响纤维素的新陈代谢参与植物的生长发育。

5.2植物病理学研究

植物抗病性及其机制研究一直是当今植物病理学和植物抗病育种中的热点和焦点问题[31]。RT-qPCR技术可以用于研究病原菌感染宿主植物的过程中，宿主植物基因表达的改变以及抗病植株与感病植株的基因表达的差异，为植物抗病机理的研究和抗病品种的选育提供理论依据[27]。到目前为止，RT-qPCR技术已在水稻[32-34]、玉米[35-37]、小麦[38-39]、大麦[40-42]、大豆[43]、豌豆[44]、黄瓜[45]、橙[46]、花生[47]、油菜[48]、葡萄[49]、蘋果[50]、辣椒[51]、杨树[52]、云杉[53]等植物中广泛应用。

5.3外源基因拷贝数分析

植物转基因研究中，外源基因在植物基因组中的拷贝数为1～2个时能够较好表达，插入拷贝数较多时会导致表达不稳定，甚至发生基因沉默现象[54]。因此，T0代转基因外源基因的拷贝数是研究植物转基因分子特性的基础步骤之一[26]。Southern-blot方法是鉴定转基因拷贝数的传统方法，但其具有操作繁琐、试剂昂贵、样品需要量大等缺点，使得研究人员消耗太多的人力、物力。实时定量PCR法克服了Southern blot的定量缺点，已被广泛应用于DNA的定量检测。Mason等[55]利用TaqMAN探针荧光定量PCR技术检测转基因番茄的目的基因的1、2、3拷贝数，并且与通过Southern blot分析所得的结果进行比较，发现前者所获信息的质量比后者更高。Yi等[56]利用荧光定量PCR技术，以单拷贝基因GhUBC1为内参，对转基因棉花的28个T0代株系的拷贝数进行成功检测，并且有效地从T1代的转基因群体中鉴定出纯合子。然而，由于转基因常常伴随着嵌合体的出现[57-58]，而荧光定量PCR技术也可用于嵌合体的检测[59]。

5.4植物病菌、病原微生物及害虫检测

植物病菌或病原微生物常常能引起多种农作物、园林观赏、经济作物及牧草发生病害。传统的检测方法主要是采用生物学和血清学方法，费时又费力。自从实时荧光定量PCR技术应用于植物病菌的检测之后，不仅有效地提高检测速度和水平，而且检测的灵敏度也比一般的检测方法高出100倍左右。还有一个明显的优点是试验中不需要PCR的后续处理及病原菌的分离培养，大大简化试验操作步骤，缩短检测时间[60]。自2002年Frederick首次将该方法应用于植物病原真菌的检测[61]，国内外已出现大量利用该技术检测病原菌的报道[62-67]。

目前，实时定量PCR技术应用于植物害虫鉴定、防治等研究相对其他领域较少，但该技术在植物害虫、植物病原线虫[68-70]和害螨[71]研究中已经显示出极好的应用前景[72]。传统的植物害虫鉴定方法依赖于形态特征和寄主范围等特征来区分，但是对于一些植物害虫之间的区分比较困难，尤其是检疫性植物害虫实蝇类[73]、蓟马类[74-75]等，而实时定量PCR技术是解决这一问题的可靠手段[72]。

5.5转基因植物鉴定

随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活。转基因食品特别是水稻、小麦、玉米等主要粮食作物的转基因品种往往具有高产、优质、抗病虫害的特点[31]。但在解决人类面临的粮食和能源危机的同时，也带来新的问题，如生态问题，转基因食品对人类健康的危害等，因此，对转基因产品的检测和定量是大家关注的焦点[26]。

荧光定量PCR技术已成为转基因产品快速灵敏检测的技术途径，并被广泛使用[76-78]。根据目前转基因技术中使用的基因构件主要来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子和NOS终止子，绝大部分转基因产品含有这2个基因片段，用检测定量这2个片段就可达到简便、快速、准确地确定是否为转基因产品[79]。

6前景

目前，实时荧光定量PCR技术还广泛应用于植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测、信号转导、环境对植物基因表达的影响等方面[27]。近年来，许多科研工作者基于荧光PCR的基本原理对荧光PCR技术进行不断深入地研究和改进，使荧光PCR技术得到进一步的完善，并在此基础上开发出许多新的荧光定量PCR技术。随着科学技术的不断发展，仪器设备和试剂费用的降低及相关知识的普及，RT-qPCR技术将成为分子生物学实验室必备的研究工具，将会广泛应用于植物研究各领域。

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