陈金武 袁华玲 齐璐璐

摘要[目的]分析金寨红阳猕猴桃提取物抗肿瘤及抑菌活性。[方法]采用水提法、醇提法提取金寨红阳猕猴桃活性物质。通过提取物对SH-SY5Y、HELA和MCF-7这3种肿瘤细胞形态结构的破坏以及生长抑制，测定其抗肿瘤活性。通过提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉以及酵母菌的生长抑制作用，分析其抑菌功能。[结果]金寨红阳猕猴桃提取物能破坏3种肿瘤细胞的细胞形态，当添加量为20.0 μL时，对SH-SY5Y的抑制率为38%±6%，对HELA的抑制率为25%±5%，对MCF-7的抑制率为24%±3%。提取物添加量为40.0 μL时，可完全抑制大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的生长。提取物添加量为80.0 μL时对黑曲霉及酵母菌没有明显的抑制作用。[结论]金寨红阳猕猴桃提取物能抑制肿瘤细胞及细菌的生长，可用于保健品及药物的开发利用。

关键词 金寨红阳猕猴桃；提取物；抗肿瘤；抑菌

中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0141-04

Abstract[Objective]The research aimed to study the antitumor and antimicrobial activity of Jinzhai Hongyang kiwi fruit extract.[Method]The active substances of Jinzhai Hongyang kiwi fruit were extracted by distilled water and ethanol respectively. The antitumor activity of the extract was measured by the destruction of the cell morphology and growth inhibition against SHSY5Y， HELA and MCF7. The growth inhibitory of the extract was also analyzed against Escherichia coli， Bacillus subtilis， Aspergillus niger and Saccharomyces.[Result]The kiwi fruit extract could destroy the morphology of three kinds of tumor cells. The inhibition rate of the extract against SHSY5Y was 38%±6% at the additive amount of 20.0 μL， and it was 25%±5% against HELA， which was 24%±3% against MCF7. The growth of escherichia coli and bacillus subtilis could be completely inhibited by the extract at the additive amount of 40.0 μL. The extract had no significant inhibition against aspergillus Niger and Saccharomyces at the additive amount of 80.0 μL.[Conclusion]Jinzhai Hongyang kiwi fruit extract can inhibit the growth of tumor cells and bacteria， and it can be used for the development of health care products and drugs.

Key words Jinzhai Hongyang kiwi fruit；Extract；Antitumor；Antimicrobial

獼猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属，是一种落叶和半落叶的常绿藤本植物[1]。该水果中含有丰富的碱类、水解酶类、果胶类、糖类物质以及维生素C等活性物质，具有清热、利尿、促进血液循环、治疗肝炎以及抗肿瘤等作用[2]。金寨猕猴桃是安徽省六安市金寨县特产，其主要品种有红阳、海沃德等适生品种，当地政府一直给予大力支持，使得猕猴桃产业已成为该地重要的支柱产业之一。

目前，将猕猴桃运用于医药保健品的开发已成为农学及生命科学的研究新热点[3]。人们已发现猕猴桃对促进神经末梢的生长恢复有一定的帮助[4]。此外，猕猴桃中的某些物质可以通过激活机体内的抗氧化酶来清除自由基，延缓机体衰老，其中多酚与其清除自由基的能力相关[5]。除了猕猴桃果实外，猕猴桃根同样具有多种功效[6]。Montefiori等[7]研究表明利用猕猴桃给予机体抗氧化剂，降低机体氧化速度，能够减缓恶性肿瘤的生长。笔者对金寨红阳猕猴桃提取物进行功能探究，分析其抗肿瘤及抑菌活性，挖掘猕猴桃药用价值，以期为当地猕猴桃的产品加工与开发提供新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 仪器

Multiskan Go全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；CO2培养箱（Thermo Fisher Scientific）；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DS-1高速组织捣碎机（广东罡然机电设备有限公司）；HXQ-QB全温振荡培养箱（常州恒隆仪器有限公司）；IX71+DP72倒置荧光显微镜（奥林巴斯株式会社）；Countstar细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；SW-CJ-2FD双人单面超净台（苏州智净净化设备有限公司）。

1.2 试材

金寨红阳猕猴桃，安徽润生农业开发有限公司；人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人宫颈癌细胞HELA、人乳腺癌细胞MCF-7、大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis、黑曲霉Aspergillus niger、酵母菌Saccharomyces，合肥师范学院生命科学学院；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、青链霉素混合液，北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基噻唑蓝（MTT），上海源叶生物科技有限公司；其余生化试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 猕猴桃活性物质提取液的制备。

1.3.1.1

水提法。将金寨红阳猕猴桃洗净去皮，精准称量猕猴桃果肉50 g，置于研钵中研磨破碎。添加200 mL去蒸馏水，85 ℃加热4 h。取加热后物质进行过滤留滤液，于3 000 r/min离心10 min，留上清并静置1 d。再次3 000 r/min离心10 min，留上清得猕猴桃水提物。

1.3.1.2

乙醇提取法。按“1.3.1.1”研磨猕猴桃果肉，添加200 mL 95%乙醇浸泡48 h，过滤留滤液。将滤液于3 000 r/min离心10 min，留上清并静置1 d。再次3 000 r/min，离心10 min，留上清得猕猴桃乙醇提取物。

1.3.1.3 活性物质提取液的制备。

将上述2种方法制备的提取物按照1∶1 比例进行混合后即制成猕猴桃活性物质提取液，置于4 ℃冰箱备用。

1.3.2

猕猴桃提取物抗肿瘤活性分析。

1.3.2.1

猕猴桃提取物对肿瘤细胞形态的影响。将培养至正常生长状态的SH-SY5Y、HELA、MCF-7 3种肿瘤细胞进行消化。吸取20 μL细胞悬液于灭菌后EP管中，加入980 μL DMEM血清培养液进行稀释。取96孔细胞培养板，每孔加入100 μL细胞稀释液待用。每种细胞设置4个待测组：高剂量组，每孔加入20 μL猕猴桃提取物；低剂量组，每孔加入5 μL猕猴桃提取物；空白组，不加入提取液；乙醇组，加入20 μL 49.5%乙醇，即活性物质提取所用溶剂。用DMEM血清培养基将每孔补齐至终体积为200 μL。将96孔板放于CO2培养箱继续培养24 h。然后在倒置荧光显微镜下观察细胞的形态。

1.3.2.2

肿瘤细胞抑制率测定。采用MTT法检测细胞生长抑制率[8]。参照“1.3.2.1”对生长状况良好的SH-SY5Y、HELA、MCF-7这3种肿瘤细胞进行消化并稀释。取96孔细胞培养板，每孔加入100 μL细胞稀释液待用。药物组：每孔分别加入2.5、5.0、10.0、20.0 μL猕猴桃提取物；空白组，不加入提取液；乙醇组，加入20 μL 49.5%乙醇。用DMEM血清培养基将每孔补齐至终体积为200 μL。将细胞样本置于CO2培养箱培养，48 h后吸去每孔液体，加入MTT溶液100 μL，在CO2培养箱中温育4 h后终止培养。弃上清液，然后加入150 μL DMSO，振荡15 min，于490 nm处检测吸光度。根据公式抑制率=（A0-A1）/A0×100%计算猕猴桃提取物对肿瘤细胞生长的抑制率。其中，A0为空白组细胞吸光度；A1为加入不同猕猴桃提取物的细胞吸光度。

1.3.3

猕猴桃提取物抑制细菌生长活性分析。将保种的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于LB固体培养基，37 ℃倒置过夜培养，挑取活化菌落。将活化菌落转接于LB液体培养基，37 ℃ 180 r/min摇床培养至对数生长期待用。取96孔细胞培养板，每孔加入99 μL LB液体培养基，并加入1 μL上述待用菌液。每孔分别加入10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μL猕猴桃提取液，用LB培养基将每孔补齐至200 μL。同时设置空白组（不加猕猴桃提取液组）、乙醇组（加入100 μL 49.5%乙醇）。上述每孔设置3个平行。将孔板置于37 ℃，150 r/min摇床振荡培养。分别培养0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，检测样品在OD600处的吸光度，绘制生长曲线。

1.3.4

猕猴桃提取物抑制真菌生长活性分析。将保种的酵母菌、黑曲霉分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基），30 ℃倒置过夜培养，挑取活化菌落。参照“1.3.3”配制试验体系。将孔板置于30 ℃，150 r/min摇床培养。分别培养0、4、8、12、16、18、24、28 h，检测样品在OD660处的吸光度。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃提取物抗肿瘤活性分析

2.1.1 猕猴桃提取物对SH-SY5Y、HELA、MCF-7细胞形态的影响。

将生长状况良好的肿瘤细胞铺到96孔板中，分别添加高剂量20 μL或低剂量5 μL猕猴桃提取物，然后置于CO2培養箱37 ℃继续培养24 h后，观察细胞形态。从图1～3可看出，空白组3种细胞生长状态均良好，贴壁生长，外形完整，大小相近；分别添加高、低剂量猕猴桃提取物则对细胞形态造成影响；经提取物处理的肿瘤细胞逐渐变圆，外形残缺不完整，最后逐渐脱落，直至细胞死亡；随着猕猴桃提取物剂量升高，细胞脱落的数量也相应增加，表明猕猴桃提取物能够在一定程度诱导SH-SY5Y、HELA和MCF-7的凋亡。

单独添加与高剂量提取物同等浓度的乙醇（乙醇组），对细胞形态没有明显影响，表明提取物中所含乙醇对细胞形态没有破坏作用。

2.1.2 猕猴桃提取物对SH-SY5Y增殖抑制。

MTT法可以用来测量细胞抑制率，了解细胞的凋亡。从图4可看出，猕猴桃提取物能够抑制SH-SY5Y细胞的生长；当提取物添加量为20.0 μL时，其对SH-SY5Y的抑制率为38%±6%，随着提取物添加量的降低，其对SH-SY5Y的抑制作用逐渐下降；当添加量降低至2.5 μL时，抑制率降至8%。乙醇对SH-SY5Y生长抑制率仅为2%，影响较小。

2.1.3 猕猴桃提取物对HELA增殖抑制。

按照“1.3.2.2”方法检测提取物对HELA的抑制作用，结果如图5所示。猕猴桃提取物能够抑制HELA的生长；当提取物添加量为20.0 μL时，其对HELA的抑制率为25%±5%；随着提取物添加量的降低，其抑制作用逐渐下降；当提取物添加量为2.5 μL时，抑制率为1%。乙醇对HELA抑制率相对较低，可以忽略提取物中乙醇对细胞的抑制效果。

2.1.4 猕猴桃提取物对MCF-7增殖抑制。

按照“1.3.2.2”方法检测提取物对MCF-7的抑制作用，结果如图6所示。当提取物添加量为20.0 μL时，其对MCF-7的抑制率为24%±3%；当添加量为2.5 μL时，抑制率为1%。乙醇对MCF-7抑制率低。

比较3种细胞，SH-SY5Y对猕猴桃提取物最为敏感，抑制率最高；HELA与MCF-7相似。另外，乙醇对肿瘤细胞生长有较低的抑制率，影响较小，可以忽略提取物中乙醇对细胞的抑制效果。

2.2 猕猴桃提取物抑制细菌活性分析

2.2.1 猕猴桃提取物抑制大肠杆菌活性。

将活化的大肠杆菌接种于96孔细胞培养板中，每孔加入不同浓度梯度的猕猴桃提取液，补齐培养基继续培养。在不同时间点检测大肠杆菌OD600的吸光度，绘制生长曲线。从图7可看出，随着提取物添加量的增加，大肠杆菌的生长受到抑制。

添加量为10.0 μL时，大肠杆菌受到轻微抑制，但仍快速生长；当添加量为20.0 μL时，其生长受到明显抑制，生长速度远低于对照组；添加量高于40.0 μL时，大肠杆菌受到完全抑制，曲线没有明显升高。

乙醇对照组对大肠杆菌的抑制效果介于加入10.0～20.0 μL 猕猴桃提取物之间，说明虽然猕猴桃提取物中所含乙醇会在一定程度上抑制细菌生长，但效果较弱。

2.2.2 猕猴桃提取物抑制枯草芽孢杆菌活性。

将活化的枯草芽孢杆菌接种于96孔细胞培养板中，加入不同浓度梯度的猕猴桃提取液，补齐培养基继续培养，并绘制生长曲线。从图8可看出，添加量为10.0 μL时，枯草芽孢杆菌生长受到轻微抑制；当添加量为20.0 μL时，枯草芽孢杆菌生长速度远低于对照组；添加量高于40.0 μL时，枯草芽孢杆菌受到完全抑制，曲线没有明显升高。

孢杆菌的生长抑制作用逐渐增强。同时，虽然猕猴桃提取物中所含乙醇会在微弱程度上抑制细菌生长，但效果较弱，提取物的抑菌作用主要来自于猕猴桃活性物质。

2.3 猕猴桃提取物抑制真菌活性分析

将活化的黑曲霉、酵母菌分别接种于96孔细胞培养板中，每孔加入不同浓度梯度的猕猴桃提取液，补齐PDA培养基继续培养。在不同时间点检测2种真菌在OD660的吸光度。结果发现，添加至80.0 μL 提取物的样品，吸光度并未明显低于空白组，说明猕猴桃提取物在添加量为10.0～80.0 μL，对于黑曲霉、酵母菌没有明显的抑制作用。

3 结论与讨论

对于水果和蔬菜中活性物质的研究是当代农学及生命科学研究的热点。其中金寨红阳猕猴桃富含各种活性物质，具有多种生理活性。该研究采用水提法和醇提法提取金寨红阳猕猴桃活性物质。通过添加提取物，分析其对SH-SY5Y、HELA、MCF-7这3种肿瘤细胞的形态结构、生长状态的影响；同时通过其对细菌及真菌的生长抑制，分析其抑菌效果。结果表明，猕猴桃提取物能破坏肿瘤细胞的形态结构，并抑制肿瘤细胞的生长。当添加量为20.0 μL时，其对SH-SY5Y的抑制率为38%±6%，对HELA的抑制率为25%±5%，对MCF-7的抑制率为24%±3%。同时，随着添加量的增大，猕猴桃提取物抑制大肠杆菌及枯草芽孢杆菌生长的作用逐渐增强；添加量达到40.0 μL时，可完全抑制2种细菌的生长。但其添加量对黑曲霉及酵母菌的生长则无明显抑制。该研究为金寨红阳猕猴桃的活性分析提供了试验基础，为其深加工及抑癌、抑菌药物的研发提供了一定的数据支持。

参考文献

[1]韦一飞，甄丹丹，甄汉深.美味猕猴桃研究进展[J].亚太传统医药，2017，13（4）：57-59.

[2]康大力，张洪利.猕猴桃属植物化学成分及其生物活性研究进展[J].中成药，2008，30（1）：116-119.

[3]朱振宁.美味猕猴桃根抑菌活性及化学成分研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2006.

[4]LEE Y C，KIM S H，SEO Y B，et al.Inhibitory effects of Actinidia polygama extract and cyclosporine A on OVAinduced eosinophilia and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma[J].International immunopharm acology，2006，6（4）：703-713.

[5]王華，曹婧，翟丽娟，等.猕猴桃果肉提取物抗氧化活性研究[J].华北农学报，2013，28（2）：144-149.

[6]马思远，黄初升，刘红星，等.中华猕猴桃根化学成分及药理活性的研究进展[J].广西师范学院学报（自然科学版），2016，33（4）：57-63.

[7]MONTEFIORI M，MCGHIE T K，COSTA G，et al.Pigments in the fruit of redfleshed kiwifruit （Actinidia chinensis and Actinidia deliciosa）[J].Journal of agricultural and food chemistry，2005，53（24）：9526-9530.

[8]徐春华.MTT法检测大豆异黄酮对癌细胞的生长抑制作用[J].中央民族大学学报（自然科学版），2012，21（1）：58-62.