张彩娟 吴宇光 郑文寅 王文余 朱宗河

摘要 杂交水稻纯度鉴定对水稻种子质量控制和降低生产经营风险具有重要意义。利用SSR标记技术，以籼稻杂交旱稻新品种鑫两优212及其亲本DNA为材料，从48对SSR引物中筛选出3对在杂交种鑫两优212中呈现双亲带型的引物。研究表明，这3对引物均可用于杂交种鑫两优212种子纯度鉴定。

关键词 鑫两优212;SSR标记;水稻;纯度

中图分类号 S511文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）34-0068-03

种子质量包括纯度、净度、发芽率、水分等，其中种子纯度是最重要，也是最容易引起生产纠纷的质量指标。我国是杂交水稻研究最早、种植面积最大的国家。在我国广泛推广的两系杂交水稻由于其母本为光、温敏核不育系，制种过程中受气候变化影响较大，如低温天气，易引起不育系的育性转换，直接影响到杂交种子纯度[1]。杂交水稻纯度影响着杂种优势强弱和产量高低。种植纯度不合格的杂交水稻种子不仅阻碍优良品种优良遗传性能的充分发挥，还会导致大面积减产，给国家、种子企业和农民带来巨大的经济损失[2]。因此，种子纯度是杂交稻种子生产经营过程中最突出、种子企业最关心的核心问题之一。

目前应用于杂交水稻种子纯度鉴定的方法主要有种植鉴定、籽粒形态鉴定、同工酶鉴定、DNA分子标记鉴定[3]。不同杂交水稻品种种子籽粒形态差异有限;同工酶法，多态性不够丰富，且有组织和器官特异性，从而限制了其应用[4];种植鉴定是最直观、最有效、最符合生产实践的纯度鉴定方法，是种子企业最倚重的鉴定方法，但由于其鉴定周期长，鉴定结果不能及时指导种子加工和销售。因此，研究和应用其他简便、快速、准确、不受时空限制的鉴定方法，辅助种植鉴定结果，弥补种植鉴定的滞后性，作为在种植鉴定结果出来之前大量销售时的初步依据，是种子企业最希望采取的方法。 SSR分子标记具有数量丰富、多態性高、无环境影响、操作快速简单、结果稳定可靠、引物序列易交流等优点，已经广泛应用于杂交稻纯度鉴定[5-12]。

鑫两优212是合肥市蜀香种子有限公司利用抗旱性较强的两系不育系蜀鑫1S与抗高温恢复系鑫恢212 2009年配组，2014年通过安徽省审定的杂交水稻新品种（审定编号：皖稻2014022），经上海市农业生物基因中心2012年抗旱性鉴定，抗旱性达1级，是国内选育的首个杂交籼型旱稻品种[13]。笔者拟利用农业部颁布的行业标准《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T 1433—2014）中推荐的48个SSR标记，筛选适合的特异引物用于该杂交种纯度的快速鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料 供试材料为鑫两优212杂交标准种及其亲本，以及纯度待测的鑫两优212样品，均由合肥市蜀香种子有限公司提供，在光照培养箱（恒温30 ℃）中培养7 d左右。SSR引物和DNA聚合酶购自上海生工，引物序列（表1）源于中华人民共和国农业行业标准《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T 1433—2014）。

1.2 方法

1.2.1 供试材料发芽。按照《农作物种子检验规程》（GB/T 3543.4—1995）要求，从鑫两优212杂交标准种、亲本及纯度待测样品中均随机取200粒种子，均匀置于发芽床上，在温度为30 ℃、光照为750 lx、湿度为75%的条件下发芽3～7 d。

1.2.2 DNA提取。DNA提取采用常规的CTAB法：取2～3 g的水稻幼苗，剪碎放入2 mL离心管中，加入1～2颗钢珠，放入液氮中5 min，将离心管取出用漩涡振荡仪粉碎，向离心管中加入500 μL预热的CTAB，盖好离心管盖放在65 ℃水浴锅中预热30 min，期间来回颠倒2～3次，预热后加入氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提液500 μL，振荡混匀后放入高速冷冻离心机中10 000 r/min离心5 min，离心结束后吸取400 μL上清液转移到1.5 mL离心管中，加入800 μL无水乙醇放入-20 ℃冰箱中冷冻30 min，沉淀DNA，然后放入离心机中10 000 r/min离心10 min，取出离心管可以看到白色透明沉淀，弃上清液。再加入70%乙醇洗涤2次，放置通风处风干，加入100 μL  TE缓冲液溶解DNA，-20 ℃保存，使用时对母液进行稀释，DNA工作液保持在50 ng/μL。

1.2.3 PCR扩增。采用10 μL的PCR反应体系：1 μL样品DNA，1 μL 10×buffer，0.6 μL 25 mmol/L MgCl 0.4 μL 5.0 mmol/L dNTP，0.1 μL 5 U Taq酶，上下游引物各0.5 μL，最后加5.9 μL的超纯水补足到10 μL。反应程序为94 ℃预变性4 min;95 ℃45 s，57 ℃45 s，72 ℃1 min，36个循环;72 ℃延伸8 min，最后4 ℃冷却10 min。

1.2.4 电泳检测。PCR扩增产物采用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。点样后，1 000 V电泳预热30  min，上样后稳压1 000 V电泳60～90 min。电泳完毕后，用10%冰醋酸溶液（1 L）固定30 min，用2%硝酸银溶液染色30  min，用预冷的3%无水碳酸钠溶液显色，ddH2O漂洗1～5  min，室温下自然晾干。拍照、观察带型、统计结果数据。

2 结果与分析

2.1 特异引物筛选

对鑫两优212标准杂交种及其亲本使用《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》 （NY/T 1433—2014）中48 对SSR引物进行PCR扩增，结果有18对引物在父母本间具有多态性，且在鑫两优212标准杂交种各单株中呈现双亲互补带型（图1），约占检测引物的37.5% （表1） ，可用于该品种的纯度鉴定。

2.2 鑫两优212杂交种纯度鉴定

随机选取纯度待测的鑫两优212幼苗100株，分别提取DNA进行纯度鉴定，以亲本（父、母本）作为对照，选取多态性好、谱带清晰稳定、非特异性扩增少的3对引物（RM72、RM3331、RM493）进行PCR扩增，在4%变性聚丙烯酰胺凝胶上点样、电泳并分析结果。谱带中出现双亲互补带型的为杂交种，其他带型为杂株（图2），以此计算纯度的百分率=杂交种单株数/检测单株数×100%。结果表明，用RM72、RM3331、RM493标记检测鑫两优212，都检测到第16、25、32、40、68、78和87号7个单株为非双亲互補带型杂株，且都是母本带型，据此计算出鑫两优212待测样品的纯度为93%。该批次样品经过合肥市蜀香种子有限公司海南异地种植鉴定和合肥正季种植鉴定，纯度鉴定结果分别为96.0%和94.5%。

3 讨论

分子标记技术能从分子水平上反映生物个体间差异，具有较高的多态性与重演性，SSR分子标记技术用于作物纯度鉴定已是成熟的技术，能以较小的成本、较短的时间准确、稳定地鉴定品种的纯度。该研究从均匀分布在水稻染色体上的48对SSR引物中筛选到18对用于鑫两优212杂交种纯度鉴定，选用其中的3对引物可以快速、较为准确地鉴定出鑫两优212纯度。从筛选的18对引物中筛选特异性较强的引物组合对鑫两优212杂交种进行鉴定，能够减少很多的工作量和成本，且效果更好，可靠性更高。

利用SSR分子标记技术进行纯度鉴定时，有些与杂交种带型有明显差异的单株在种植鉴定时并不一定表现出表型性状的差异，因此SSR分子标记技术用于纯度鉴定时，可以有效鉴别出大田无法确定的表型以及难以鉴别的植株，因而分子鉴定和种植鉴定结果必然存在一定的差异，而种植鉴定是最符合生产实践的纯度鉴定方法，如何使分子鉴定结果更接近种植鉴定、更好地辅助种植鉴定结果还需进一步研究。

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