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小麦赤霉病菌对常用杀菌剂的抗性研究

2018-05-14周仁先

安徽农业科学 2018年21期
关键词:多菌灵抗性小麦

周仁先

摘要 [目的] 研究小麦赤霉病菌对常用杀菌剂的抗性。[方法]测定从带病麦穗标本中分离得到的小麦赤霉病菌株对多菌灵、戊唑醇杀菌剂的抗药性,并利用紫外光诱导得到抗性突变菌株,同时测定了抗药突变菌株菌丝的生长量,分析了抗性突变菌株产孢及孢子萌发特性,最后提取并测定了脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素含量。 [结果]安徽、江苏地区的田间已检测到小麦赤霉病菌抗性菌株,紫外光诱导也获得了该病菌抗性菌株;抗性菌株在菌丝生长和产孢量方面与敏感菌株无显著差异,但孢子萌发率远低于敏感菌株;样品中的DON毒素含量随着病情级别和病粒率的增加而增加,根据病粒率来测算DON毒素含量具有一定的实用性。[结论]该研究为小麦赤霉病的抗性治理提供对策。

关键词 小麦;赤霉病菌;多菌灵;戊唑醇;抗性

中图分类号 S435.121.4+5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2018)21-0152-03

Abstract [Objective] To study resistance of Fusarium graminearum to common fungicides in wheat.[Method]The resistance of Fusarium graminearum in wheat isolated from diseased wheat ear specimens to carbendazim and tebuconazole fungicides was determined. At the same time, the mycelium growth of drugresistant mutant strain was determined, and the sporulation and spore germination characteristics of resistant mutant strain were analyzed. Finally, the content of deoxynivalenol (DON) toxin was determined.[Result] The resistant strain of Fusarium graminearum in wheat had been detected in the field of Anhui and Jiangsu, and the resistant strain was also induced by ultraviolet light, and there was no significant difference between the resistant strain and the sensitive strain in hyphae growth and sporulation. But spore germination rate was much lower than that of sensitive strains.The level of DON toxin in samples increased with the increase of disease grade and disease rate. It was practical to calculate the content of DON toxin according to the rate of diseased grains.[Conclusion]The study provides a solution for resistance management of Fusarium graminearum in wheat.

Key words Wheat;Fusarium graminearum;Carbendazim;Tebuconazole;Resistance

小麥是世界三大谷物之一,在我国分布广泛,是我国主要的粮食作物,其种植面积仅次于水稻。小麦在种植过程中病害发生频繁,造成严重的损失。目前小麦生产中常见的病害有小麦条锈病、小麦叶锈病、小麦秆锈病、小麦白粉病、小麦赤霉病、小麦纹枯病等。其中,小麦赤霉病是麦类作物上最重要的流行病害之一。小麦赤霉病在我国黄淮小麦主产区发生严重,部分地区收获的小麦中赤霉病菌含量超标严重。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),即小麦赤霉病菌,是我国乃至全世界小麦赤霉病的最主要致病菌。此类真菌破坏力很强,能在几周时间内摧毁大面积的高产作物,严重影响了谷类作物的生长。在我国多菌灵、戊唑醇是防治该病害的主要药剂,但由于此类杀菌剂的长期使用,导致我国很很多地区出现了小麦赤霉病菌对多菌灵、戊唑醇等常见杀菌剂的抗性问题[1-2]。随着病菌抗药性的日趋加强,我国很多地区赤霉病的发生也更加严重,同时也出现了污染问题。为了杜绝药剂的不合理使用、杀菌剂防治失效和小麦病害的大范围发生,笔者检测了小麦赤霉病菌对常用杀菌剂多菌灵、戊唑醇的抗药性,并进一步了解抗性发生的原因和类型,以期为小麦赤霉病的抗性治理提供对策。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

供试药剂。98%多菌灵,由安徽广信农化股份有限公司生产;戊唑醇,由江苏瑞德邦化工科技有限公司生产。

1.1.2

供试菌株。从河南、安徽、江苏等地采集的扬麦13、扬麦15、扬麦16、宁麦13带病麦穗标本,分离小麦赤霉病病原菌,获得单孢菌株。

1.2 方法

1.2.1

小麦赤霉病菌抗药性测定。将分离纯化获得的赤霉病菌菌株于25 ℃培养3 d后,用100 μL枪头打成约5 mm的圆孔,再用灭菌后的牙签分别接种至含有杀菌剂多菌灵、戊唑醇的PSA平板上,并做对照处理(不含杀菌剂),每个平板接种8株菌株。多菌灵和戊唑醇的浓度均为1、3、5、10、15 μg/mL,放置于培养箱培养3 d。用十字法测量菌落直径,每处理重复3次,取平均值,计算其对菌丝生长的抑制百分率和相对防效,再根据相对防效的概率值和药剂对数值的线性回归分析,求出毒力回归方程和抑制菌丝生长的有效中浓度(EC50),并在含有不同浓度的PSA平板上测定其对相关菌株的最低抑制浓度(MIC)。

1.2.2

紫外光诱导抗性菌株。用5 mm孔径的高温灭菌枪头打孔,用灭菌牙签将随机选取的10株敏感菌株接种至CMC培养基中,在25 ℃条件下振荡培养4 d使之产孢;用经灭菌的滤纸过滤收集孢子于离心管中,8 000 r/min离心5 min,弃上清,孢子沉淀在底部,用无菌水悬浮混匀,使孢子浓度约为105个/mL;吸取以上浓度的孢子液均匀涂布于多菌灵和戊唑醇的PSA平板上,将该平板距离紫外光源20 cm直接紫外光照射90 s,然后迅速转入黑暗条件培养,8 d左右后长出抗性突变菌株。

1.2.3

抗药突变菌株菌丝生长量测定。将经紫外光诱导获得的抗性突变菌株接种于PSA平板上,在25 ℃条件下培养3 d,测量菌落直径,并计算出线性生长速率。在100 mL PD培养液中接种4个菌碟,于25 ℃下120 r/min振荡培养4 d,每处理3次重复,菌丝过滤、抽干后称量干重。

1.2.4

抗性突变菌株产孢及孢子萌发特性。选取在PSA平板上培养3 d的敏感菌株和抗突变菌株菌丝各20 mg,分别接种在100 mL 4%的绿豆汤培养基上,于25 ℃下200 r/min振荡培养5 d使之产孢,采用血球计数板计算出产孢量。取适量孢子用无菌水稀释10倍,采用清水萌发法于25 ℃下分别于8、16、22、26 h计算孢子的萌发率和芽管长度。每处理3次重复。

1.2.5

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素提取和测定。取2.0 g样品粉末,置于50 mL离心管中,加入10 mL 乙腈∶水(V∶V)为84∶16的提取液,涡旋1 min,置于转速200 r/min的摇床过夜,取2 mL上清液经TRILOGYTC-T200型净化柱净化。取适量上述净化后的样品至自动进样瓶,在流动相为水∶甲醇∶乙腈(V∶V∶V)=90∶5∶5、紫外检测器波长220 nm、流速1 mL/min、进样量15.0 μL、柱温箱25 ℃、色谱柱 Agilent Eclipse XDB-C18分析柱(250.0 mm×4.6 mm,5.0 μm)的条件下,测定DON毒素含量。

2 结果与分析

2.1 小麦赤霉病菌的抗药性

由图1可知,从样品上分离得到的赤霉病菌分别接种至5 μg/mL多菌灵和5 μg/mL戊唑醇的药板上,多菌灵的药板上敏感菌株完全被抑制,而抗性突变菌株可以生长;戊唑醇的药板上,敏感菌株具有一定的耐药性,而在菌碟边缘有微小菌丝长出。可能是由于其对这2種药剂的抗性机制不同造成的。

用此方法检测了90株赤霉病菌。由表1可知,江苏地区分离到的抗性菌株为50株,其中18株对多菌灵有明显抗性,抗性比为36%;安徽地区分离到的抗性菌株为40株,其中4株对多菌灵有明显抗性,抗性比为10%。对戊唑醇未检测到产生抗性的菌株,可能是由于戊唑醇的作用机理与多菌灵不同所致。

2.2 紫外光诱导获得的抗药突变体

经过紫外光诱导后,频率为1×10-4 的菌株能在多菌灵药板上生长,但转代3~4代后敏感性恢复,只有经紫外光诱导后的抗药突变体菌株经转代后仍能在多菌灵PSA平板上生长。其对多菌灵的毒力回归方程为Y=13.428 6+14.342 3X,相关系数r为0.966 7,EC50为14.21 μg/mL,EC50值是敏感菌株的26倍。

2.3 抗药突变菌株的生长情况

由图2可知,敏感菌株和抗药突变菌株在生长速率方面无显著差异。转9代后,抗药突变菌株的生长速率超过敏感菌株。抗药突变菌株和敏感菌株的菌丝干重增长率分别为0.178、0.165 mg/d,这与线性生长速率趋势一致。

2.4 敏感菌株和抗药突变菌株产孢和孢子萌发能力

由图3可知,转1代后敏感菌株和抗药突变菌株的产孢量分别为2.0×106和3.0×106个/mL,转13代后敏感菌株和抗药突变菌株的产孢量分别为3.5×106和2.8×106个/mL。这表明转代使抗药突变菌株的产孢能力下降,敏感菌株的产孢能力略有升高。当敏感菌株的孢子萌发率为100%时,抗药突变菌株仅为57.0%。敏感菌株和抗药突变菌株在16 h时孢子萌发的芽管长度分别为0.017、0.028 mm;在22 h时,分别为0.034和0.078 mm。

2.5 产DON毒素能力

设定浓度分别为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L 7种DON毒素标准样,采用HPLC进样检测,得到相应的峰面积,再利用各浓度及其对应的峰面积得出线性回归方程。由图4可知,标准曲线为Y=19.259X,R2=0.996 9。由此可知,抗药突变菌株的样品中DOC毒素含量较敏感菌株下降了2.5倍。

3 结论与讨论

3.1 结论

该试验检测了菌株对小麦赤霉病菌常用杀菌剂多菌灵和戊唑醇的敏感性特性。通过紫外光诱导获得抗药突变菌株,抗药突变菌株与敏感菌株在菌丝干重、生长速率和产孢能力等方面均无显著差异,但转代后的抗药突变菌株在产孢能力、生长速率方面与敏感菌株具有一定差异,这表明抗药突变菌株可能难以稳定生长。通过比较抗药突变菌株和敏感菌株的孢子萌发能力和芽管长度,发现抗药突变菌株的孢子萌发能力远低于敏感菌株。小麦赤霉病菌抗药突变菌株由于繁殖能力低,导致其在田间的竞争力也有所削弱。研究表明,小麦赤霉病菌抗药突变菌株的致病力较敏感菌株有所下降,且紫外光诱导获得抗药突变菌株在转代后很容易恢复敏感性,这可能是导致抗药突变菌株在田间发生频率低的主要原因[3-4]。

3.2 讨论

小麦赤霉病是一种气候性病害,其流行因素很多,但主要与开春后初侵染的菌源量、扬花期的温湿度等有关。在我国,对小麦赤霉病的防治主要采用抗病品种和化学药剂。目前我国对小麦赤霉病表现高抗的品种资源匮乏,加上小麦的抗病性和高产性无相互统一,使得赤霉病抗性小麦品种的选育进程缓慢[5-8]。

小麦赤霉病的发生与菌源量和气候条件有关,因此在防治过程中可以将这两点作为改善对象。赤霉病菌主要是在禾谷类作物的残体上越冬,小麦播种前要深耕灭茬尽量降低菌源量。此外,将小麦与非禾本科作物轮作,可以有效减轻赤霉病的发生。气候方面,可以适当提前播种,以便扬花期提前,错开有利于赤霉病发病的气候条件[9-11]。

小麦赤霉病菌对多菌灵类苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的最主要原因是此类药剂与病原菌的亲和性逐渐下降。多菌灵类苯并咪唑类杀菌剂会与靶标真菌生物体内的β-微管蛋白进行特异性结合,干扰微管的装配,由于微管在植物有丝分裂过程中具有重要作用,这就导致细胞正常的有丝分裂受到干扰,生长受到抑制[12-13]。小麦赤霉病菌虽然对常用杀菌剂多菌灵普遍存在抗药性,但试验过程中未发现戊唑醇的抗性菌株,这表明戊唑醇在田间具有较好的防治效果,可作为多菌灵的替代药剂。

小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性水平呈加快趋势,江苏和安徽地区抗性水平以每年约10%的速度增长,尤其是在赤霉病大流行的年份。对于未检测出抗性菌株的戊唑醇,对其进行室内抗性诱导,很难得到高抗菌株,唯一的抗性菌株仅处于低抗水平,这主要是由于戊唑醇作用方式的特殊性导致。基于此,笔者建议在小麦赤霉病流行地区,可以改变原来的耕种模式,打破小麦赤霉病菌的循环路径;播种前对籽粒进行药剂处理,适当早播,尽量使小麦扬花期避开赤霉病的传播;坚持“见花打药”,提早预防;当多菌灵的抗性菌株比例达10%以上时,该药剂的推荐剂量已不能有效防治小麦赤霉病,需要用其他药剂代替。

参考文献

[1] 宋益民,丛国林,陈怀谷.多菌灵及其复配制剂防治小麦赤霉病的应用效果[J].植物保护学报,2018,45(2):352-358.

[2] 宋阳阳,林杨,罗汉钢,等.湖北省小麦赤霉病菌对多菌灵、戊唑醇和咪鲜胺的敏感性[J].农药学学报,2016(6):724-728.

[3] 段亚冰,效雪梅,杨莹,等.一种基于LAMP技术快速检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性方法的建立及应用[J].南京农业大学学报,2016,39(1):97-105.

[4] 陈骧.小麦赤霉病菌的抗药性研究及抗性治理[D].杭州:浙江大学,2015.

[5] 陈宏州,肖婷,许媛,等.小麦赤霉病菌对多菌灵和不同杀菌剂敏感性的相关分析[J].农学学报,2016,6(9):31-36.

[6] 邵莒南.防治小麦赤霉病高效药剂筛选及其作用方式研究[D].泰安:山东农业大学,2015.

[7] 侯昌亮,胡寒哲,艾爽,等.11种杀菌剂对小麦赤霉病菌的抑制作用[J].湖北农业科学,2014(17):4066-4068.

[8] 许娟.安徽小麦赤霉病菌生物学特性及遗传多样性研究[D].合肥:安徽农业大学,2012.

[9] 周永进.小麦赤霉病致病菌基因化、化學型分化及其致病力分析[D].南宁:广西大学,2012.

[10] 姚金保,陆维忠.小麦新品种生选6号的丰产稳产性和赤霉病抗性分析[J].麦类作物学报,2012,32(4):793-798.

[11] MELLENBORN C,STEINER U,LUDWIG M,et al.Effect of fungicides on the complex of Fusarium species and saprophytic fungi colonizing wheat kernels[J].Eur J Plant Patho,2008,120:157-166.

[12] HOU Y P,LUO Q Q,CHEN C J,et al.Application of tetra primer ARMS-PCR approach for detection of Fusarium graminearum genotypes with resistance to carbendazim[J].Australas Plant Pathol,2013,42:73-78.

[13] LUO C X,SCHNABEL G.The cytochrome P450 lanosterol 14αdemethylase gene is a demethylation inhibitor fungicide resistance determinant in Monilinia fructicola field isolates from Georgia[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(2):359-366.

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