于海涛 宋顺 赵春华

摘要 [目的]研究功能基因对小麦苗期不同氮磷水平下根系性状影响。[方法]以科农9204与京411构建的KJ-RIL群体为材料，进行苗期低氮、低磷及对照水培。对苗期根系性状结合10个功能标记进行基因型分类汇总分析。[结果]高分子量麦谷蛋白Glu-A1、Glu-B1，小麦细胞壁转化酶基因TaCwi-A1，小麦黄色素含量基因Psy-B1等显著影响对照、低条件小麦苗期根系的主根长、根体积、根面积、根尖数以及总根长，且影响不完全一致；小麦多酚氧化酶基因PPO-A1对低磷条件下根系性状影响较大；矮秆基因Rht-B1b、Rht-B1a仅影响苗期株高，低分子量麦谷蛋白Glu-A3、小麦蔗糖合成酶基因TaSus2、籽粒硬度相关基因Pinb等对根系性状无明显效应。[结论]该研究为小麦合理施肥提供理论依据。

关键词 小麦；根系性状；功能基因

中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0055-06

Abstract [Objective] To research the effects of functional genes on root traits of wheat at different nitrogen and phosphorus levels at seedling stage. [Method]With a recombinant inbred line （RIL） population derived from two Chinese winter wheat varieties Kenong9204 and Jing411 as the research mateirals， we studied the root morphology at seedling stage under normal nitrogen （CK） condition， low nitrogen （LN） condition， and low phosphorus condition. Genetic effects of ten known genes on root related traits were studied using the corresponding functional markers. [Result] GluA1， GluB1， TaCwiA1 and PsyB1 were significantly correlated with root morphology including main root length， root volume， root area， tip number and the total root length under CK and LN conditions. These effects were distinct to some extent under different nutrition conditions. PPOA1 are significantly correlated with root morphology under LP condition. RhtB1b and RhtB1a were significantly correlated with the height in seedling stage. GluA3， TaSus2 and Pinb did not have any effects on root morphology at seedling stage. [Conclusion] This research provided theoretical foundation for the rational fertilization of wheat.

Key words Wheat；Root traits；Functional gene

根系是小麥吸收水分和营养的主要器官，根系的生长、根群分布、根系构型、不同发育时期的根系吸收水分和养分的活力以及不同环境条件下根系的变化，都会影响小麦的生物发育及最终产量[1]。小麦为异源六倍体，基因组巨大，80%以上为重复序列。根系作为数量性状极易受环境的影响，给小麦根系的科学研究带来阻碍[2-4]。目前，对于小麦根系的研究较少，大多限于表型或正向遗传学的研究方法。

功能标记是与表型相关的功能基因基序中功能性单核苷酸多态性位点开发而成的新型分子标记[5]。由于不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下确定目标等位基因的有无，目前功能标记已广泛应用于品种的鉴定和分子辅助育种[6-8]。Ellis等[9]开发了矮秆基因Rht1、Rht2 和Rht8 的分子标记；He等[10]开发的多酚氧化酶（PPO）活性等位基因[10]；He等[11-12]开发了八氢番茄红素合成酶（PSY）等位变异基因；Jiang等[13]和Ma等[14]分别开发了TaSus2、TaCwi-A1等产量相关基因标记；科研人员还研究了高低分子麦谷蛋白[15-17]、籽粒硬度[18]等品质相关性状功能标记在以科农9204和京411构建的KJ-RIL群体中的分离情况。在此基础上，笔者以科农9204与京411构建的KJ-RIL群体为材料，进行苗期低氮、低磷及对照水培；对苗期根系性状结合10个功能标记进行基因型分类汇总分析，研究不同氮磷条件下各功能基因对小麦根系的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用材料为科农9204、京411及以两者为亲本构建的188个F6：7代重组近交系群体（简称KJ-RIL群体）。

1.2 试验设计

试验共设3个处理：处理T1于2012年11月在北京（116.46° E；39.92° N）进行，共21 d，对188个KJ-RIL群体的前1-94家系（KJ-RIL1-94）分别进行正常对照（CK）、低氮（LN）和低磷（LP）处理；处理T2于2012年12月在北京（116.46° E；39.92° N）进行，共28 d，对188个KJ-RIL群体的前1-94家系（KJ-RIL98-188）分别进行正常对照（CK）、低氮（LN）和低磷（LP）处理；处理T3于2014年11月在石家庄（114.51° E；38.04° N）进行，共16 d，对188个KJ-RIL群体的1-188家系（KJ-RIL1-188 ）分别进行正常对照（CK）和低氮（LN）处理。

1.3 苗期根系性状的表型测定

共设置对照（CK：2 mmol/L NO3-+0.2 mmol/L PO43-）、低氮（LN：0 mmol/L NO3-+0.2 mmol/L PO43-）和低磷（LP：2 mmol/L NO3-+0 mmol/L PO43-）共3个处理。营养液配方参考An等[3]对小麦苗期氮吸收研究中所用方法。选种时挑选饱满、均匀的小麦种子于铺有滤纸的培养皿中，5‰ H2O2浸泡处理24 h，然后用去离子水清洗3次并用适量去离子水浸泡放置于常温，待其露白后置于4 ℃环境下2 d，取出置于常温。7 d后长至一叶一心期选择生长一致的健壮幼苗去胚乳移至1/2营养液中缓苗3 d，再换为完全培养液培养液（pH=6.0）。培养箱放置于温室内，由吹氧机补氧（1 h/1 d），并随机调换摆放位置。保持温度夜间（125 ℃）、日间（225 ℃），相对湿度50%～70%，每日光照12 h，移栽后第n天取样，测其株高（PH）、最大根长（RL）、胚芽鞘长度（CL）；将茎叶部和根部分开，利用ScanMaker i800 plus扫描仪（300 DPI分辨率）对根部扫描后应用万深LA-S根系分析系统批量处理分析根系图片并逐一进行精确修正获得总长（RL）、根表面积（RS）、根体积（RV）、根直径（RD）和根尖数（RT）等参数。然后把幼苗放在烘箱里100 ℃杀青20 min，80 ℃烘干至恒重，称量株干重（PDW）、根干重（RDW）、茎叶干重（SLDW）。

1.4 DNA的提取和PCR分析

采用CTAB法[19]提取供试材料的基因组DNA，略作调整。扩增反应在TakaRa PCR thermal cycler上进行，25 μL体系中加入DNA（30 ng/μL）2 μL，10×Buffer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.5 μL，TaqE（5 U/μL）0.2 μL，Primer（25 μmol/L）1.5 μL + 1.5 μL；所有引物均使用降落PCR（Touchdown PCR），即94 ℃变性4 min，接着15个循环的复性温度降落程序，每个循环 94 ℃变性45 s，65 ℃复性50 s（-1 ℃/循环）和72 ℃延伸55 s；最后30 个循环的普通PCR程序即：94 ℃ 变性40 s，50 ℃复性 40 s，72 ℃延伸40 s；最后72 ℃ 延伸5 min；扩增结束后10 ℃保存。

PCR扩增产物用6%的聚丙烯酰胺非变性凝胶（39∶1）电泳进行检测，硝酸银染色后，观察并拍照。

1.5 分子标记

该研究所用15个功能分子标记信息见表1。其中小麦品质相关功基因的能标记包括Glu-B1、Ax2*、Glu-A3 、Psy-B1和 PPO[10-12，15-17]；产量相关功基因的能标记包括TaCwi-A1和TaSus2-2B[13-14]；株高相关功基因的能标记包括Rht-B1a和Rht-B1B[9] 。

2 结果与分析

2.1 科农9204和京411的基因型分析

15个功能标记在科农9204和京411中的扩增结果见图1。扩增结果显示，高分子量麦谷蛋白亚基Glu-B1功能标记ZSBy9aF1/R3在科农9204中扩增出662 bp目的片段，在京411中扩增出707 bp的片段，结合高分子量麦谷蛋白SDS-PAGE结果，科农9204在Glu-B1的等位基因是7+9，京411在Glu-B1的等位基因為2+12。同理，科农9204在Glu-A3的等位基因是Glu-A3b或者Glu-A3d，京411在Glu-A3的等位基因是Glu-A3a或者Glu-A3c。科农9204在TaCwi-A1具有降低粒重的TaCwi-A1b等位基因，京411在TaCwi-A1具有增加粒重的TaCwi-A1a等位基因。科农9204在TaSus2-2B具有增加千粒重的优异等位基因，而京411在TaSus2-2B具有降低粒重的非优异等位基因。科农9204在小麦籽粒硬度的关键基因位点Pinb-D1等位基因为Pinb-D1b，京411在该位点的等位基因为Pinb-D1a。科农9204、京411在小麦黄色素含量基因Psy-B1的等位基因分别是Psy-B1b和Psy-B1c。而高分子谷蛋白Glu-A1亚基AX2、多酚氧化酶基因PPO等位基因PPO33仅在京411中检测到1250和380 bp的目的片段，表明京411中含有高分子谷蛋白Glu-A1亚基AX2和多酚氧化酶基因PPO等位基因PPO33，科农9204不含两等位基因。矮秆基因功能标记Rht-B1b和Rht-B1a分别在科农9204和京411中检测到237和237 bp的目的片段，表明科农9204和京411在Rht-B1位点的等位基因分别是Rht-B1b和Rht-B1a。

2.2 功能标记在188个KJ-RIL家系的基因型分析

由于同一基因的多个功能标记表现为共分离，以10个基因位点对其在188个KJ-RIL家系中基因型值分离情况进行统计分析。由表2可知，Glu-B1、Ax2*、Glu-A3 、TaCwi-A1和TaSus2-2B位点在188个KJ-RIL家系中均符合1∶1分离比例；Psy-B1和 PPO共2个位点在188个KJ-RIL家系中不符合1∶1分离比例，遗传比例均偏向京411。

2.3 不同处理功能基因对根系性状的影响

2.3.1

高分子量麦谷蛋白Glu-A1。 由图2可知，T3处理CK条件下，来自科农9204 Glu-A1的等位基因AX2显著增加小麦根系体积、根面积，LN条件下显著增加小麦根系体积；T1、T2处理两表基因型间虽未达显著差异，但整体趋势一致。因此，来自科农9204 高分子量麦谷蛋白基因Glu-A1的等位基因AX2增加CK和LN条件下根体积以及LN条件下的根面积。

2.3.2

高分子量麦谷蛋白Glu-B1。由图3可知，T1和T3处理CK条件下，来自于科农9204 Glu-B1的等位基因7+9相对于京411的2+12 显著降低小麦根系的总根长、根面积、根体积；另外，CK条件下的根尖数，LN条件下苗期株高、总根长、根面积虽仅在T1处理两基因型表型间差异显著，但在T2和T3处理中整体趋势一致。因此，高分子量麦谷蛋白Glu-B1的等位基因7+9相对2+12显著降低CK条件下小麦根系总根长、根面积、根体积，以及LN条件下根系根尖数以及苗期株高。

2.3.3 细胞壁转化酶TaCwi-A1。由图4可知，T3处理中CK和LN条件下，相对于京411增加粒重的TaCwi-A1a等位基因，来自于科农9204具有降低粒重效应的TaCwi-A1等位基因TaCwi-A1b可显著提高小麦根系根尖数和主根长，其中根尖数在T1和T2处理中整体趋势一致，但主根长在低氮低磷环境下表型复杂多变。T2处理中LN条件下，TaCwi-A1b相对于TaCwi-A1a可提高总根长、根尖数。因此，相对于TaCwi-A1a，细胞壁转化酶TaCwi-A1等位基因TaCwi-A1b显著增加CK条件下的小麦根系主根长、根尖数，以及LN条件下的总根长、根尖数。

2.3.4

黄色素含量基因Psy-B1。由图5可知，T2和T3处理中CK和LN条件下，相对于来自京411的Psy-B1c，来自于科农9204 Psy-B1的等位基因Psy-B1b显著增加小麦根系主根长。

2.3.5 多酚氧化酶PPO。 由图6可知，CK条件下，T1处理中相对于来自于京411的等位基因Ppo-A1b，来自于科农9204 PPO的等位基因Ppo-A1a显著降低根体积，但与T3处理的整体趋势不一致；LN条件下，无明显效应；LP条件下，相对于来自于京411的等位基因Ppo-A1b，T1处理中来自于科农9204 PPO的等位基因Ppo-A1a显著降低小麦根系总根长、根面积、根尖数，与T2处理趋势一致。

因此，在CK和LN氮条件下，PPO33对根系影响复杂，且易受环境影响；LP条件下PPO的等位基因Ppo-A1a相对于Ppo-A1b可显著降低小麦根系总根长、根面积和根尖数。

2.3.6

矮秆基因Rht-B1b和Rht-B1a。由图7可知，T1、T2处理中CK、LN、LP条件下，来自于科农9204的突变型Rht-B1a和来自于京411的野生型Rht-B1b均显著降低小麦苗期株高。

2.3.7 低分子量麦谷蛋白基因GluA3。与来自京411等位基因Glu-A3a/Glu-A3c相比，CK條件下T1处理中来自科农9204的等位基因Glu-A3b/Glu-A3d显著增加小麦苗期株高、根系总根长、根面积、根体积；T2处理虽未达显著水平，但基本一致；T3处理的一致性较差； LN条件下，T1处理增加苗期株高，但T2处理降低株高； LP条件下，T1、T2、T3处理各根系性状基因型间无显著差异。由此可见，低分子量麦谷蛋白基因GluA3对根系影响复杂，且在不同环境中表达不稳定。

2.3.8

蔗糖合成酶基因TaSus2。相对于来自于京411无此标记的家系，在CK条件下T3处理中含来自科农9204的高千粒重单倍型功能标记Sus2-SNP-185/589H2的家系主根长显著增大，与T2、T1处理的整体趋势不一致；相对于来自于京411无此标记的家系，在LN和LP条件下T2处理中含来自科农9204的高千粒重单倍型功能标记Sus2-SNP-185/589H2的家系小麦根系面积、根体积、总根长、根尖数显著降低，T2、T1处理的整体趋势不一致。因此，蔗糖合成酶基因TaSus2对根系影响复杂，且在不同环境中表达不稳定。

2.3.9

籽粒硬度Pinb。在CK、LN、LP条件下，T1、T2、T3处理中根系各性状中均未检测到显著差异。因此，籽粒硬度相关基因Pinb对根系无显著性影响。

3 结论与讨论

功能基因组学和生物信息学的飞速发展、基因功能标记的开发与应用为小麦等重要农作物分子育种以及品种鉴定带来了新思路、新发展。该研究基于功能基因的“一因多效”，将标记检测信息和小麦根系性状紧密联系起来，建立一一对应关系，分析已知功能基因对小麦苗期根系主根长、根体积、根面积、根尖数以及总根长的遗传效应。

高分子谷蛋白Glu-B1以及Glu-A1亚基AX2不同等位基因在对照、低氮处理中显著影响小麦根系总根长、根体积和根面积；多酚氧化酶PPO等位基因PPO33在低磷处理中显著影响小麦根系的总根长、根面积和根尖数；黄色素含量基因Psy-B1不同等位基因在正常和低氮条件下显著影响小麦根系的主根长。这表明高分子谷蛋白Glu-B1、Glu-A1，多酚氧化酶PPO，黄色素含量基因Psy-B1等除影响小麦高分子谷蛋白含量、多酚氧化酶活性、黄色素含量外，对小麦根系的生长也有一定的影响。

前人有研究表明，小麦株高与根系呈正相关，而该试验显示多环境多处理下Rht-B1b和Rht-B1a对苗期株高均有显著影响，但对根系一系列性状无明显遗传效应，表明小麦根系不受矮秆基因Rht-1影响。

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