张聪 樊丽博 杨会鲜 张继颖 姚路路 周冰 张晓会

摘要 [目的]建立五加芪粉中总糖的含量测定方法，以控制五加芪粉的质量。[方法]采用苯酚-硫酸比色法，检测波长为494 nm，以无水葡萄糖为对照品对五加芪粉中总糖的含量进行测定。[结果]无水葡萄糖对照品溶液的线性范围为0.342～1.035 mg/mL（r=0.999 4），平均加样回收率为98.5%，RSD=3.3%（n=6）。[结论]该研究确定的方法简单、可靠、准确，可用于测定五加芪粉中总糖的含量。

关键词 五加芪粉;总糖含量;苯酚-硫酸比色法

中图分类号 R284.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）33-0147-02

五加芪粉是洛阳惠中兽药有限公司研制开发的新型中药免疫增强剂，已取得农业部三类新兽药注册证书。本品具有补中益气、扶正祛邪的功效，用于提高禽的机体免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。该制剂由黄芪和刺五加两味中药组成，研究表明黄芪多糖和刺五加多糖均具有显著的免疫促进作用[1-3]，为本品的主要有效成分。为有效控制五加芪粉的质量，需研究并建立其多糖含量测定方法，但由于多糖组成复杂，需将其水解为单糖后再进行测定，目前多采用葡萄糖作为对照品测定样品中多糖的相对含量。笔者建立了苯酚-硫酸比色法测定五加芪粉总糖的含量，并进行方法学考察。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。五加芪粉，由洛阳惠中兽药有限公司提供;D-無水葡萄糖对照品（批号110833-200904，中国食品药品检定研究院，99.5%）。

1.1.2 主要仪器。UV-2100型紫外-可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司;AB265-S型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司;HS3120型超声波清洗器，上海楚定分析仪器有限公司。

1.1.3 主要试剂。苯酚、硫酸为分析纯;水为纯化水。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成含无水葡萄糖0.6 mg/mL的溶液，即得。

1.2.2 供试品溶液的制备。取供试品50 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 苯酚-硫酸比色法。精密量取对照品溶液与供试品溶液各2 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，置水浴中保温15 min，取出，置冰水浴中冷却3 min，加水稀释至近刻度，再置冰水浴中冷却3 min，取出，加水至刻度，摇匀;另量取水2.0 mL，同上平行操作作为空白对照，按照紫外-可见分光光度法，在494 nm波长处测定吸光度，按外标法以吸光度计算供试品中多糖的含量[4-5]。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 测定波长的选择。精密量取对照品溶液与供试品溶液各2 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5 mL，摇匀，置水浴中保温15 min，取出，置冰水浴中冷却3 min，加水稀释至近刻度，再置冰水浴中冷却3 min，取出，加水至刻度，摇匀;另精密量取水2.0 mL，同上平行操作作为空白对照，按照紫外-可见分光光度法，在波长400～600 nm扫描。

1.2.4.2 线性关系考察。称取无水葡萄糖对照品5份，分别约为15.0、22.5、30.0、40.0、50.0 mg，精密称定，分别置于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为0.342 3、0.437 8、0.638 8、0.833 8、1.034 8 mg/mL的对照品溶液。精密量取5个不同浓度的对照品溶液各2 mL，分别置25 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法测定。以吸光度（Y）为纵坐标、无水葡萄糖对照品溶液浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.4.3 精密度试验。取“1.2.4.2”制备的0.638 8 mg/mL无水葡萄糖对照品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法连续测定6次，测得葡萄糖吸光度，计算RSD。

1.2.4.4 重复性试验。精密称取同一批号的供试品（批号20120201）50 mg，按照“1.2.2”方法制备供试品溶液，平行制备6份，测定吸光度，计算总糖的平均含量和RSD。

1.2.4.5 稳定性试验。取同一份供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、30 min测定吸光度，计算RSD。

1.2.4.6 加样回收率试验。称取已知含量的供试品（批号20120201）25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入无水葡萄糖对照品15 mg，加水溶解并定容至刻度，摇匀，平行操作6份，按照“1.2.3”方法测定吸光度，计算平均回收率和RSD。

1.2.5 样品的含量测定。取3批供试品，按照“1.2.2”方法制备供试品溶液并测定，计算总糖的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 测定波长的选择。图1表明，按“1.2.4.1”方法操作，对照品溶液和供试品溶液均在494 nm左右有最大吸收，故选择494 nm作为样品的测定波长。

2.1.2 线性关系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以吸光度（Y）为纵坐标、无水葡萄糖对照品溶液浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程为Y=0.792 7X-0.028 8（r=0.999 4），表明0.342～1.035 mg/mL葡萄糖浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验。按“1.2.4.3”方法操作，连续测定6次，测得葡萄糖吸光度RSD为0.2%，表明该方法精密度良好。

2.1.4 重复性试验。按“1.2.4.4”方法操作，测得总糖的平均含量为619 mg/g，RSD为1.2%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验。按“1.2.4.5”方法操作，计算吸光度的RSD为1.7%，表明供试品溶液在30 min内稳定性良好。

2.1.6 加样回收率试验。按“1.2.4.6”方法操作，由表1可见，平均回收率为98.5%，RSD为3.3%，表明该方法准确可靠，可用于五加芪粉中总糖的含量测定。

2.2 含量测定 由表2可知，五加芪粉中总糖的含量为613～623 mg/g，相对偏差为0.16%～0.44%。

3 結论与讨论

多糖含量的测定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等，其中苯酚-硫酸法是常用测定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖等的测定，方法简单，准确性较好，灵敏度高，适用范围广泛[6-7]。

黄芪为五加芪粉的君药，黄芪多糖为黄芪提升免疫的主要有效成分，因此方法研究过程中参考了黄芪多糖注射液的含量测定方法[8]，但其供试品溶液制备方法繁琐，而且测定过程中对照品和供试品溶液经苯酚-硫酸显色后定容至10 mL，五加芪粉使用其方法测定结果偏差较大。该研究中的方法供试品溶液制备过程简便，测试溶液最终定容至25 mL，平行样品测定结果偏差较小。五加芪粉采用这2种方法测定结果一致。

该研究中的方法扫描对照品溶液和供试品溶液的最大

吸收波长均在494 nm左右，而目前苯酚-硫酸法测定多糖含量时测定波长一般为490 nm，这可能是因为供试品溶液浓度的不同导致显色后溶液的最大吸收波长不一致，五加芪粉在490和494 nm波长条件下测定的结果一致，但494 nm波长下的灵敏度更高，因此，确定测定波长为494 nm。

该研究建立了五加芪粉中总糖含量的测定方法，方法学考察表明，该方法精密度、重复性良好，可准确测定总糖的含量，从而有效控制五加芪粉的质量。

参考文献

[1] 刘树民，张娜.刺五加多糖的现代研究进展[J].中医药信息，2014，31（2）：116-119.

[2] 段雪磊，马奎红，包永占，等.刺五加免疫调节功能的研究进展[J].中兽医学杂志，2015（6）：72-75.

[3] 李钦，胡继宏，高博，等.黄芪多糖在免疫调节方面的最新研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（2）：199-206.

[4] 陈芬芳，苏建青，褚秀玲.刺五加多糖含量测定方法的建立[J].畜牧与饲料科学，2014，35（9）：19-20.

[5] 张洪波，任春晓.黄芪叶提取及黄芪多糖测定方法研究[J].黑龙江医药，2005，18（1）：6-8.

[6] 杨莉，王志华，陶健生.黄芪中黄芪多糖含量测定方法的比较[J].中国医药工业杂志，2005，36（9）：562-563.

[7] 张媛媛，张彬.苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法测定绿茶茶多糖的比较研究[J].食品科学，2016，37（4）：158-163.

[8] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2015年版二部）[S].北京：中国农业出版社，2016.