刘海洋 王琦 王伟 张仁福 韩万里 姚举

摘要 从新疆棉田中分离获得一株细菌AL7， 利用形态观察、生理生化性状测定结合16S rDNA、gyrB序列分析对菌株AL7进行种属鉴定， 测定了菌株AL7及其挥发性气体对棉花黄萎病菌Verticillium dahliae的拮抗能力， 利用酸沉淀法粗提菌株AL7的抑菌活性物质， 并测定了该活性粗提物对棉花黄萎病菌生长及其孢子萌发的拮抗能力， 利用薄层层析法对活性物质进行了初步分离。结果表明， 菌株AL7为甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus， 该菌株对棉花黄萎病菌具有极强的抑制作用， 分泌在PDA平板中的抑菌物质对病原菌的抑制持效期达14 d以上， 该菌株产生的挥发性气体对棉花黄萎病菌的抑制效果达59.2%； 菌株AL7的脂肽粗提物对棉花黄萎病菌抑制率达到82.8%， 能够充分抑制大丽轮枝菌孢子的萌发， 抑菌圈直径为36.1 mm， 生物自显影分析表明， 菌株AL7分泌的抑菌活性物质Rf值约为0.75～0.83， 该菌株在防治棉花黄萎病方面表现出较好的应用前景。

关键词 拮抗菌； 甲基营养型芽胞杆菌； 抑菌活性物质； 生物自显影分析

中图分类号： S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017215

Abstract The bacterial strain AL7 was isolated from the cotton field in Xinjiang. It was identified through morphologic observation， physiological and biochemical character determination and 16S rDNA and gyrB gene sequence analysis. The antagonistic effect of strain AL7 and its volatile gas that suppresses Verticillium dahliae growth were tested by confrontation culture method. Anti-fungal active ingredients of strain AL7 were extracted by acidic precipitation. The antagonistic effect of the active ingredients suppressing V. dahliae growth and their spore germination activities were tested by Oxford-cup test and plating method. The active substances were preliminarily separated by thin-layer chromatography method. The results indicated that strain AL7， identified as Bacillus methylotrophicus， had strong antagonistic effect on the growth of V. dahliae， with an inhibition zone of 33 mm in diameter and a lasting period of 14 d. The antibacterial effect of its volatile gas was above 50%. The antibacterial effect of the active crude extracts of strain AL7 was above 80%， which could sufficiently suppress the spore germination of V. dahliae. The diameter of inhibition zone was 36.1 mm and the Rf value of the anti-fungal active ingredient was about 0.75 to 0.83. Our research suggests that strain AL7 has good development prospect for control of cotton Verticillium wilt.

Key words antagonistic bacterium； Bacillus methylotrophicus； antifungal active ingredient； bioautography analysis

隨着全国棉花种植重心向新疆转移， 新疆棉区在我国棉花产业中的战略地位愈加凸显。棉种跨区调运、病区秸秆还田、常年连作等突出问题导致棉花黄萎病在新疆发生加重而原因复杂[1]， 已成为新疆棉花产业发展的严重制约因素， 急需找到适合新疆棉区的控制棉花黄萎病措施。

棉花黄萎病的病原为大丽轮枝菌Verticillium dahliae， 其具有致病力分化严重， 变异速度快的特点[2]， 现阶段缺乏有效手段防治该病。化学农药的减量施用已成为大势所趋， 生物防治在棉花黄萎病的防控方面展现出巨大优势。前人筛选到大量对棉花黄萎病有较好抗菌效果的生防菌株[312]， 枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis NCD-2制剂对棉花黄萎病的防治效果可达70%[3]。抗菌蛋白、脂肽类抗生素、环二肽等是生防细菌产生的主要抑菌活性物质， 此类物质能够破坏病原菌细胞膜的结构，使其变形和裂解， 抑制病原菌生长[1315]。

新疆地理环境独特， 土壤盐碱度高。实践应用中发现， 利用国内现有生防菌剂等产品防治棉花黄萎病时， 存在防治效果不稳定的问题。而菌株AL7是自新疆严重发病棉田内分离到的一株生防细菌， 对新疆地域生态环境高度适应， 对棉花黄萎病菌的拮抗能力极强， 具有较好的应用前景。拟通过本研究， 完成对菌株AL7的种属鉴定， 测定该生防菌的抑菌活性物质对棉花黄萎病菌的拮抗能力， 为研究菌株AL7的生防机制打下基础， 为棉花黄萎病的防治提供生防资源， 为研制适应新疆生态环境的棉花黄萎病生防产品提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及药品

供试菌株： 细菌AL7从石河子市棉花黄萎病发生严重棉田土壤中分离； 棉花黄萎病菌Verticillium dahliae由本实验室分离保存。

培养基： 马铃薯葡萄糖培养基 （potato dextrose agar， PDA）； 肉汤培养基 （lysogeny broth agar， LB）； 可溶性淀粉培养基 （soluble starch agar）； 脱脂牛奶培养基 （skim milk agar）； 茯苓粉培养基 （tuckahoe powder agar， ABP）； 纤维素刚果红培养基 （cellulose cong red agar）。以上培养基均添加去离子水至1 L， 自然pH， 121℃高压蒸汽灭菌25 min。

供试试剂： 细菌DNA基因组试剂盒、三氯甲烷、甲醇、浓盐酸、卢哥式碘液等。

供试仪器： 显微镜、高速冷冻离心机、PCR仪、牛津杯、TLC板、层析缸等。

1.2 菌株AL7的形态观察、生理生化性状测定及生防相关酶检测

将菌株AL7接种于LB斜面上，35℃培养24 h，挑取少量菌体用无菌水稀释，分别取10-4和10-5稀释液100 μL涂布LB培养基平板，30℃培养24 h，观察菌落形态；挑取LB斜面上35℃培养24 h的菌株AL7进行革兰氏染色，显微观察其菌体及芽胞形态；参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株AL7分别进行生长温度等生理生化指标测定[16]。淀粉酶检测：取新活化的菌株AL7穿刺接种于含1%可溶性淀粉的平板上，30℃培养72 h，待形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥式碘液染色2 min， 然后快速用70%乙醇洗板， 观察菌落生长处无色透明圈形成情况； 蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶检测： 取新活化的菌株AL7分别穿刺接种于脱脂牛奶琼脂平板、ABP平板、刚果红平板上， 30℃培养72 h后观察菌落外围透明圈形成情况。每处理均3次重复。

1.3 菌株AL7的 16S rDNA、gyrB序列分析及脂肽类抗生素合成基因检测

采用 DNA 提取试剂盒， 提取菌株AL7的总DNA， 进行16S rDNA、gyrB序列[17]以及脂肽类抗生素合成基因ituC、ituA、ituD、fenB、fenD、fenACE、sfp、srfAA、bmyB、bymC、mycB扩增[18]， 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测， PCR 产物直接测序， 采用双向测序方法， 测序工作由北京鼎国昌盛生物公司完成， 将测序得到的16S rDNA、gyrB序列与GenBank數据库中的核苷酸序列进行BLAST分析， 从中获取相近的序列， 利用MEGA 6 neighbor-joining法构建系统进化树。本研究所用试剂盒、引物、Marker及反应体系均购自北京鼎国昌盛生物公司。

1.4 菌株AL7对棉花黄萎病菌的拮抗能力测定

用直径5 mm打孔器在棉花黄萎病菌菌落边缘取菌块接入PDA平板中心， 距中心30 mm处利用无菌牙签点接或划线接种菌株AL7， 以仅接种病原菌的平板作为对照， 待对照组病原菌长满平板时测量菌株AL7对病原菌的抑菌带宽度及病原菌生长量。每处理3次重复。

按上述方法利用无菌牙签在PDA平板中央两侧点接菌株AL7， 培养10 d后， 为逐步排除活菌干扰，用无菌刀片将平板上一端生长有菌株AL7菌落的培养基去除， 继续培养7 d后， 去除平板上另一端菌株AL7， 再培养7 d， 测量病原菌生长量变化情况， 用以测定菌株AL7分泌活性物质的抑菌稳定性。以仅接种病原菌的平板作为对照， 每处理3次重复。

将菌株AL7在LB平板上划线培养， 将直径5 mm的棉花黄萎病菌接种于PDA平板中心， 将以上2个平板对扣后用封口膜密封， 将空白LB平板与接种病原菌的PDA平板对扣处理为对照， 26℃培养， 15 d后测各处理病原菌生长量， 每处理3次重复。

1.5 菌株AL7活性物质提取[19]及其拮抗能力测定

取新活化的菌株AL7接种于LB培养液中， 30℃， 160 r/min培养3 d， 8 000 r/min离心20 min去沉淀， 取上清液， 6 mol/L HCl调节pH至2.0， 静置于4℃冰箱中过夜。后经8 000 r/min， 4℃， 20 min离心收集沉淀， 将沉淀物在电热鼓风干燥箱中65℃烘干， 再用甲醇抽提， 抽提液用细菌过滤器 （d=0.2 μm）过滤， 将过滤后的抽提液用旋转蒸发仪减压蒸干， 得到脂肽粗提物（CLP）， 备用。

采用打孔法、平板涂抹法与管碟法测定菌株AL7脂肽粗提物对棉花黄萎病菌的拮抗能力。脂肽粗提物浓度为1 000 μg/mL （溶剂为2.5% DMSO）。将棉花黄萎病菌菌块接入PDA平板中心， 在距PDA平板中心30 mm处直线两端利用直径5 mm打孔器打孔， 孔内加入200 μL菌株AL7脂肽粗提物， 另一孔内加入200 μL甲醇作对照， 测定病原菌的生长量； PDA培养液中接种棉花黄萎病菌， 27℃， 120 r/min培养7 d， 利用无菌纱布过滤后制成孢子悬浮液， 取500 μL孢子悬浮液在PDA平板上涂抹均匀， 之后放置牛津杯于此平板之上， 加入100 μL的菌株AL7脂肽粗提物， 测定对棉花黄萎病菌孢子的抑制情况； 将200 μL的菌株AL7脂肽粗提物涂抹于PDA平板之上， 将棉花黄萎病菌菌块接入平板中心， 测定病原菌的生长量， 以未涂脂肽粗提物的平板处理为对照。以上试验处理及对照均3次重复。

1.6 菌株AL7活性物质的生物自显影分析[20]

在超净工作台中将TLC薄层层析板 （silica gel to 60， units 20 cm×20 cm HX083296）用灭菌剪刀剪成 10 cm长的铝板。标记样品点样位置， 样品距层析板底部1 cm， 距两边2 cm， 点样， 待样品完全干燥后将铝板垂直放入预先加有展开剂（三氯甲烷∶甲醇∶水体积比为65∶25∶4）的层析缸中（20 cm×20 cm）， 凡士林密封； 当前沿流动相移动至约7～9 cm时， 取出层析板， 在超净工作台中吹干 （至少要干燥1 h以上）， 使有机溶剂挥发完全， 防止影响病原菌生长； 沿前沿处剪下， 后将条带贴于涂有大丽轮枝菌孢子的培养基上， 室温放置 2 h， 使样品扩散至培养基中。取下层析板， 25℃培养3 d， 观察试验结果， 抑菌带位置指示了通过TLC分离的抗菌物质的位置。试验3 次重复。

1.7 数据分析

利用Microsoft Excel 2010軟件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株AL7的形态观察、生理生化性状测定及生防相关酶检测

菌株AL7在LB平板上生长良好， 菌落近圆形， 表面有明显皱褶， 干燥， 不透明， 近白色，革兰氏阳性， 菌体杆状， 产芽胞。

生理生化试验结果如表1所示， 菌株AL7革兰氏染色阳性， 耐盐性强， 在12%的氯化钠中可生长， 耐高温， 能够利用（NH4）2HPO4、KNO3、甘露糖、麦芽糖、可溶性淀粉， 有运动性， 能使明胶液化， 产H2S； 呈阳性反应的有硝酸盐还原、柠檬酸盐、酪素水解、淀粉水解、葡萄糖氧化、接触酶、脲酶、PHE脱氨酶、V-P反应； 甲基红反应、吲哚试验呈阴性。与文献报道中甲基营养型测定性状相符， 而与文献报道中解淀粉芽胞杆菌在麦芽糖和柠檬酸盐利用、甲基红反应、酪素水解、吲哚试验、PHE脱氨酶、H2S产气等方面存在不同。

综合菌株AL7形态特征和生理生化特性， 参照《常见细菌系统鉴定手册》进行检索， 初步鉴定菌株AL7为芽胞杆菌属。

菌株AL7能够产生多种与生防相关的酶， 该菌株在可溶性淀粉平板上30℃培养72 h后， 滴加卢哥式碘液染色后形成了平均直径25.6 mm的明显透明圈 （图1 a）， 具有较强的产淀粉酶能力； 在脱脂牛奶平板上30℃培养72 h后， 形成了平均直径21.2 mm的明显透明圈 （图1b）， 具有较强的产蛋白酶能力； 同时， 菌株AL7具有产葡聚糖酶和纤维素酶的能力， 其在茯苓粉平板 （图1c）、刚果红平板 （图1 d）上培养72 h后， 形成了较小的透明圈。

2.2 菌株AL7的16S rDNA与gyrB序列分析

将菌株AL7的16S rDNA 序列进行BLAST 分析， 选择序列相似性高的序列， 采用邻接法构建系统进化树。菌株AL7与模式菌株甲基营养型芽胞杆菌B.methylotrophicus（登录号：EU194897.1）和解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens（登录号：HM107806.1）归为一个分支（图2a）， 16S rDNA序列分析结果可将菌株AL7确定为芽胞杆菌属， 但未直接鉴定到种。

以菌株AL7的gyrB基因序列与文献报道[32]的模式菌株的gyrB基因序列比对结果构建系统发育树， 菌株AL7与甲基营养型芽胞杆菌B.methylotrophicus（登录号：JN896940.1）可归为一支， 亲缘关系最近且遗传距离一致（图2b）， 利用gyrB基因序列鉴定菌株AL7为甲基营养型芽胞杆菌。2株解淀粉芽胞杆菌（登录号：KC311724.1、JX014631.1）归为一支。

综合该菌株的形态特征、生理生化特性及16S rDNA 序列与gyrB 基因序列分析结果， 将菌株AL7鉴定为甲基营养型芽胞杆菌。

2.3 菌株AL7对棉花黄萎病菌的拮抗能力测定

在PDA平板上将菌株AL7与棉花黄萎病菌对峙培养20 d， 菌株AL7在PDA平板上生长良好， 形成直径约20.1 mm的菌落， 其对棉花黄萎病菌表现出极强的抑制作用， 抑菌带宽平均为13.2 mm， 充分抑制了棉花黄萎病菌在培养基上的生长， 致使其菌落呈梭形（图3a）。

试验发现， 菌株AL7发酵上清液对大丽轮枝菌菌落生长及其孢子萌发没有明显的抑制效果， 为测定菌株AL7活性物质抑菌持久性， 在PDA平板上将菌株AL7与棉花黄萎病菌进行两侧对峙培养，10 d后菌株AL7明显抑制了棉花黄萎病菌的生长，接种AL7处理病原菌菌落直径分别为17.6 mm、10.5 mm，而空白处理病原菌菌落直径为44.3 mm；去除病原菌单侧的菌株AL7记为AL7 R处理，将其继续培养7 d，此时， 接种AL7处理病原菌菌落直径为19.0 mm，增加1.4 mm； AL7 R处理中病原菌菌落直径为10.5 mm， 未增加； 而空白处理病原菌菌落直径为62.0 cm； 去除AL7 R处理中病原菌另一侧的菌株AL7后再继续培养7 d， 此时， 接种AL7处理病原菌菌落直径为19.7 mm， 继续增加0.7 mm， AL7 R处理中病原菌菌落直径为11.5 mm， 较7 d前增加1.5 mm， 而空白处理病原菌菌落长满全皿， 直径为84.7 mm。结果表明， 随着AL7菌株的移除， AL7处理14 d病原菌直径增加2.1 mm， AL7 R处理14 d病原菌直径增加1.0 mm， 棉花黄萎病菌没有明显恢复生长， 其分泌在培养基中的活性物质具有较好的抑菌持久性， 能够长期抑制病原菌的生长（图4）。

2.4 菌株AL7产挥发性气体对棉花黄萎病菌的抑制能力

在PDA平板上将菌株AL7与棉花黄萎病菌对扣培养15 d， 菌株AL7对扣处理的大丽轮枝菌的菌落直径平均为30.2 mm， 而空白处理大丽轮枝菌的平均菌落直径为74.5 mm， 经计算， 菌株AL7挥发性气体对大丽轮枝菌抑菌效果为59.2%， 表明菌株AL7产生的挥发性气体对棉花黄萎病菌的生长有明显的抑制作用（图5）。

2.5 菌株AL7的活性粗提物对棉花黄萎病菌的拮抗能力

菌株AL7抑菌活性粗提物的平板打孔法测定结果显示 （图6a）， 菌株AL7的抑菌活性粗提物致使棉花黄萎病菌菌丝生长异常， 菌落出现明显褶皱， 棉花黄萎病菌完全不能向含有活性粗提物的一侧生长， 显示出明显的拮抗效果； 平板涂抹法 （图6c）测定菌株AL7的活性粗提物对棉花黄萎病菌的平均抑制率达到82.8%； 牛津杯法测定菌株AL7活性粗提物对棉花黄萎病菌孢子萌发抑制的结果表明， 菌株AL7活性粗提物能够充分抑制大丽轮枝菌孢子的萌发， 形成的抑菌圈直径平均为36.1 mm （图6d）。

2.6 菌株AL7脂肽类抗生素相关合成基因检测

经PCR检测， 拮抗菌株AL7含有ituA、ituD、fenB、sfp、srfAA、bmyB、bymC 7种参与脂肽类抗生素合成的基因（图7）。其中， ituA和ituD为伊枯草素合成酶基因， fenB为丰原素合成酶基因， sfp和srfAA为表面活性素合成调控基因， bmyB和bymC为芽胞菌霉素合成酶基因。

2.7 菌株AL7活性物质的生物自显影分析

拮抗菌株AL7的脂肽类抗生素粗提物生物自显影分析表明， 菌株AL7的活性粗提物只产生了一条明显的抑菌带， 该物质能够显著抑制大丽轮枝菌孢子的萌发 （图8）， 经计算， 该活性物质的Rf值约0.73～0.83。

3 讨论

研究表明， 甲基营养型芽胞杆菌对多种植物病害具有较好的防治效果， 刘伟等筛选到2株分别对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum等多种病原菌有较强生防效果的甲基营养型芽胞杆菌LW-6-1[22]和LW-4[33]， LW-6-1对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为95.34%和93.98%； LW-4菌懸液对烟草青枯病菌的防治效果为70.37%， 对烟草有明显的促生作用。王洪梅等从土壤中筛选出一株甲基营养型芽胞杆菌N5， 具有产生铁载体、β-1，3-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶以及多种脂肽类抗菌物质的能力， 该菌与有机肥二次发酵产物对番茄青枯病菌R. solanacearum盆栽防效达69%[34]。谢学文等筛选得到一株对黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare具有较强拮抗活性的甲基营养型芽胞杆菌WF-3， 该菌株活体盆栽条件下对黄瓜炭疽病的防治效果为66.48%， 田间防效最高达73.70%[17]， 以上研究表明甲基营养型芽胞杆菌具有较为广阔的开发应用前景。

菌株AL7经鉴定为甲基营养型芽胞杆菌B.methylotrophicus， 翟枫等曾初步报道了甲基营养型芽胞杆菌 LW-4在棉花黄萎病防治上的应用[35]， 但并未对该菌株抗菌活性物质进行研究。刘伟等报道甲基营养型芽胞杆菌LW-4的抑菌物质对烟草青枯病菌R. solanacearum的抑菌圈直径达37.8 mm[33]。本文研究表明， 菌株AL7高度耐盐， 能产大量的淀粉酶和蛋白酶， 其活菌体对棉花黄萎病菌V. dahliae具有极强的抑菌能力， 该菌株产生的挥发性气体对棉花黄萎病菌的抑制效果达50%以上。利用涂抹法、打孔法测定发现， 拮抗菌AL7发酵液对大丽轮枝菌菌丝生长和孢子萌发没有明显抑制作用， 但是， 利用酸沉淀法提取的菌株AL7分泌的抑菌活性粗提物对棉花黄萎病菌的菌丝生长抑制率达到80%以上， 并能够充分抑制该菌孢子的萌发， 抑菌圈直径为36 mm， 抑菌效果明显， 与黄霄等[21]研究结论一致， 表明菌株 AL7抑菌能力主要是菌体竞争。

拮抗作用是芽胞杆菌防治植物病害的一个重要机制， 其通过产生抗菌代谢产物抑制病原菌的生长繁殖或直接杀死病原菌， 从而达到防治植物病害的目的[36]。芽胞杆菌分泌的抗菌代谢产物主要有蛋白类物质[3738]、脂肽类抗生素[3942]及其他类别物质[4344]。吴燕燕等研究发现， 甲基营养型芽胞杆菌抗菌肽能够延长罗非鱼片的保质期4 d以上[45]。吕倩等首次报道从海洋中分离得到一株甲基营养型芽胞杆菌SHB114， 分离纯化得到了具有较强抑制活性的bacillomycin Lc类脂肽， 对黄瓜炭疽病菌C.orbiculare、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporium f.sp. cucumeris等植物病原真菌的抑制作用较强[46]。菌株AL7经检测含有伊枯草素、表面活性素、丰原素等多种脂肽类抗生素合成基因， 利用酸沉淀法提取到的菌株AL7的脂肽类抑菌粗提物对棉花黄萎病菌菌丝生长和孢子萌发抑制作用明显， 生物自显影分析表明该活性物质Rf值约为0.75～0.83， 其挥发性气体中同样含有对棉花黄萎病菌具有明显抑制作用的物质， 具体是何种物质还需进行深入研究。

菌株AL7自新疆棉区严重发生黄萎病棉田内健康棉株根际土壤中分离获得， 其能够更好地适应新疆农田生态环境， 具有较好的在新疆开发应用的前景， 下一步通过液相色谱、制备HPLC等分析化学手段解析菌株AL7产生的抑菌活性物质， 深入研究菌株AL7的生防机制， 为该菌株的开发应用提供基础。

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（责任编辑：田 喆）