王光函，孙小玲，邹桂欣，尤献民，辛旭阳，刘 晶，李国信＊＊

（1.辽宁省中医药研究院 沈阳 110034；2.辽宁省药品检验检测院 沈阳 110023）

射干，始载于《神农本草经》[1]，其味苦、辛，性寒，微毒，归肺、肝经。具有祛痰利咽、消癖散结、清热解毒、消肿止痛的功效，临床常用于治疗感受风热或痰热壅盛引起的咽喉肿痛、痰涎壅盛，及咳嗽气喘等症，是中医治疗喉痹咽痛之要药。综合分析古典医籍及现代文献[2-6]，确定射干临床上用于治疗发热、恶寒、咳嗽、咯痰、口渴、胸痛或闷、气短等症状，症常见于急性气管-支气管炎、感染后咳嗽（PIC）、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管哮喘合并感染等气道感染性疾病。

呼吸道合胞病毒（RSV）属副粘液病毒科，肺炎病毒属，是PIC发病及感染的重要感染病原之一，也是医院交叉感染的主要病原。现代医学[7]认为病毒感染导致了气道变应性炎症、气道上皮损伤、气道高反应等。本研究基于射干临床病种筛选试验结果，确定了感染后咳嗽为射干临床治疗病种后，拟采用RSV感染豚鼠咳嗽模型[8]，通过对感染后豚鼠肺组织形态学影响，肺泡灌洗液中白细胞总数及分类计数变化，细胞因子白介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）、白三烯-4（LTC4）表达影响，来研究射干提取物对RSV感染后咳嗽模型抗炎作用。

1 材料

1.1 动物与细胞

雄性纯白SPF级豚鼠30只，250-300 g(北京实验动物中心)；呼吸道合胞病毒（武汉病毒研究所赠予）；Hep-2细胞（江苏齐氏生物科技有限公司）。

1.2 药物与仪器

射干提取物（实验室自制）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（CORNING）；胰酶(碧云天生物技术有限公司)；枸橼酸（沈阳市试剂一厂）；IFN-γ、IL-4、LTC4 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；ELX800型酶标仪（BioTek，美国）；石蜡切片机（莱卡）；BX53显微镜（奥林巴斯）。

2 方法

2.1 射干提取物的制备

射干药材1 kg，加70%乙醇提取2次，合并提取液，浓缩至无醇味，用乙醇调整至含醇量为30%，上于D101大孔吸附柱上，用3倍量30%乙醇除杂，继用80%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥至干，即得（每1 g提取物含20.7 g射干药材）。

2.2 Hep-2细胞培养、RSV扩增及组织培养半数感染量（TCID50）的测定

Hep-2细胞使用DMEM培养液（含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 g·L-1链霉素），37℃，5%CO2培养箱中常规培养。生长状态良好的细胞每2-3天传代。

Hep-2细胞在培养瓶中长至70-80%融合，吸出培养液，PBS洗2次，加入1 mL无血清培养液，取病毒悬液100µL接种于细胞上，每15 min摇动1次，吸附2 h后倒出病毒液，加入含5%胎牛血清培养液，于第2-3天开始出现细胞病变（CPE），待病变达60-70%时收获病毒，将细胞反复冻融2-3次后，1 000 r·min-1，离心5 min，去除细胞碎片，收集上清分装后，-80℃保存。

取对数生长期Hep-2细胞接种96孔板（1×104cells/well），5%CO2、37℃培养箱培养24 h，细胞贴壁并形成均匀单层时吸弃培养液。梯度稀释病毒至10-3-10-（8病毒液用维持液10倍系列稀释）6个梯度，每孔加100 μL，每列一个稀释度，共6列。其余6列加入培养液，作空白对照。37℃、5%CO2吸附2 h，吸弃病毒液，每孔加维持液100 μL，置培养箱中继续培养，逐日观察病变程度并记录。以最高稀释度不再出现新病变时为终点，结果只记录最后一天病变情况即可。用Reed-Muench公式计算病毒半数细胞感染量(TCID50)。本次实验病毒半数细胞感染量(TCID50）为7×105TCID50。

2.3 RSV感染豚鼠模型的制备及分组

健康豚鼠，常规饲养，一周后开始正式试验。试验分空白组，RSV感染模型组、射干提取物给药组（600 mg·kg-1·日-1），每组10只。

RSV感染模型制备：除空白组外，将其余各组豚鼠放入自制450 mm×450 mm×900 mm熏笼中，每5只一笼，以锯末50 g+10支香烟点燃烟熏，每次30 min，每日1次，连续10天，自由进食吸水，从第5天开始将豚鼠乙醚浅麻后鼻腔滴注100TCID50的RSV悬液100µL（每天滴鼻2次，早晚各1次，空白组给予相同剂量的5%DMEM培养液），连续给药1周。滴入量以体重1µL·g-1计算。给药组自第5天开始给药。

2.4 射干提取物对实验动物镇咳作用的观察

于末次给药45 min时，将动物置于5 L大烧杯中，底部加少量垫料，烧杯口用保鲜膜封，以4.5 mol·L-1枸橼酸溶液雾化吸入激发，每次30 s，观察5 min内豚鼠咳嗽次数。

2.5 肺泡灌洗收集

将豚鼠用2%戊巴比妥（25 mg·kg-1）麻醉后仰卧固定于操作台，打开胸腔，暴露气管和双肺，结扎右主支气管，在隆突上用套管针穿刺至左肺，气管上段剪开插入灌流管，将预温至37℃的生理盐水经气管插管注入肺内，每次灌入2-3 mL，停留30 s，回吸液体，反复3次，灌洗液回收率为70-85%。2 000 r·min-1，4℃离心10 min，上清液分装保存于-20℃冰箱，备用。细胞沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，在全自动模块式血液体液分析仪上测定白细胞总数、淋巴细胞计数、单核细胞计数及中性粒细胞计数。

2.6 ELISA法测定肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、LTC4的含量

按照试剂盒要求测定各组豚鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、LTC4的含量。

2.7 对肺组织形态学影响

结扎右主支气管，采用4%多聚甲醛固定右肺中叶，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察肺组织形态结构。

2.8 统计学处理

数据处理采用SPSS18.0统计软件，结果Xˉ±S表示，采用单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01有极显著差异。

3 结果

3.1 射干提取物对实验动物镇咳作用的观察

模型组5 min内咳嗽次数显著高于空白组，提示造模成功；而咳嗽潜伏期无显著差异。给药组中，射干提取物对模型动物5 min内咳嗽有显著抑制作用。结果见表1。

表1 射干提取物对枸橼酸引起咳嗽的影响结果(ˉ±S,n=10)

表1 射干提取物对枸橼酸引起咳嗽的影响结果(ˉ±S,n=10)

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

图1 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中IL-4、IFN-γ表达的影响

图2 射干提取物对RSV感染豚鼠肺泡灌洗液中LTC4表达的影响

3.2 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中细胞学的改变

模型BALF中白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞明显高于空白组(P＜0.05)，说明模型建立成功。给药组与模型组相比，BALF中白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞显著降低(P＜0.05)。见表2。

3.3 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中IL-4、IFN-γ含量及比例的变化

RSV感染豚鼠后，模型组中IL-4水平明显高于空白组（P＜0.05），而IFN-γ水平明显低于空白组（P＜0.05）。给药后，豚鼠BALF中IL-4水平明显降低（P＜0.05），IFN-γ水平明显增高（P＜0.05）结果见图1、表3。

3.4 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中LTC4表达的影响

RSV感染豚鼠后，模型组中LTC4水平明显高于空白组（P＜0.05），给药后LTC4水平明显低于模型组（P＜0.05）。结果见图2、表3。

3.5 射干提取物对RSV感染豚鼠肺组织形态的影响

RSV感染豚鼠后，模型组与空白组相比，可见肺泡壁增厚，有炎性细胞出现，形态变形，并有充血。给药组所有症状均有减轻。

4 讨论

《普济方》数据库管理系统[9]可以对任何一味中药进行跨病种检索，检索结果可得此药复方配伍用于所有病证的构成、各病证配伍此药频数。基于《普济方》数据库古方配伍应用考证结果表明，含射干复方所治疾病以喉痹咽痛、咳嗽、咳喘、咽干、痰热壅盛诸病与2015年版《药典》[10]一部所记功能主治完全吻合。现代文献学研究表明，射干具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等药理作用。结合传统中医药理论研究结果，考虑急性气管-支气管炎（风邪犯肺证）及感染后咳嗽（余热未清证）在炎性表现方面一急一慢，发病方面风热犯肺表现在前期，后期入里化热、余热未清，颇具代表性，故选择此二证为射干临床应用试验病征。前期临床研究结果表明：射干清咳片组与对照组（肺宁片组）治疗后比较虽然没有统计学意义，但从日间、夜间咳嗽、咯痰、痰量评分数值变化可看出，射干清咳片改善明显，证明其治疗感染后咳嗽及急性气管-支气管炎临床疗效确切。

表2 射干提取物对RSV感染豚鼠肺泡灌洗液中细胞学的影响

表3 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中LTC4、IL-4、IFN-γ表达的影响

图3 射干提取物对RSV感染豚鼠肺组织病理切片图

根据临床两个证型的试验结论，结合感染后咳嗽在患病人群中更为常见，患者量较大，患者长期咳嗽不愈，易给患者造成很大心理负担，精神上形成紧张，严重影响患者生活质量，反复检查易造成医疗成本过大，且从疾病角度出发感染后咳嗽在临床上没有更为有效的治疗手段，而急性气管-支气管炎目前临床治疗药品颇为丰富如：抗感解毒冲剂、止咳平喘的川贝批把膏等，所以我们首先选择了感染后咳嗽作为射干作用机制研究的动物模型。

感冒后咳嗽绝大部分由呼吸道病毒感染后引起，又称为感染后咳嗽，目前有关感染后咳嗽的机制知之甚少，缺乏满意的治疗[11]。感染后咳嗽虽然最终大多可以自愈，但过程中可能会严重影响患者的工作和生活，因此，进行病毒感染引起的咳嗽，尤其是感染后咳嗽发病机制的探讨将具有重要的意义。现代医学认为感冒后咳嗽的发病与病毒感染后所产生的变应性炎症、气道上皮损伤、气道神经末梢暴露、神经源性炎症反应及其导致的气道高反应有关[12,13]。

呼吸道变应性炎症产生与Th1/Th2类细胞因子失衡有关，Th1/Th2比例降低是呼吸道变应性炎症发生主要因素，且Th2类细胞因子优势表达是其形成及进展的关键机制[14]。Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ及Th2细胞分泌的细胞因子IL-4与呼吸道变应性炎性反应关系密切，IFN-γ能促进细胞表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，并抑制Th2细胞的增殖；直接通过气道给予IFN-γ，可抑制抗原激发小鼠特应性气道炎症。白三烯(LTS)是花生四稀酸(Aracliidonic Acid，AA)经5-脂氧酶途径合成代谢产生并具有多种生物活性的脂肪酸,包括LTB4和LTC4等，LTS是引起和加重气道炎症的重要炎症介质,从而导致气道上皮损伤,使咳嗽感受器暴露过多,引起咳嗽敏感性增高[15]。因此对肺泡灌洗液中的IL-4、IFN-γ及LTC4进行测定。

实验结果表明，采用RSV感染豚鼠模型，BALF细胞学及肺组织病理学检查支持气道炎症改变，表明感染后咳嗽模型成功。射干提取物给药组能减少豚鼠咳嗽次数，降低BALF中IL-4含量，升高IFN-γ含量，使IL-4/IFN-γ的比值降低，调节Th1/Th2免疫失衡；并且射干提取物能降低BALF中LTC4水平，显著减少炎性细胞数量，抑制炎性细胞浸润，说明射干提取物可能通过调节Th1/Th2平衡、抑制LTC4表达而抑制炎性介质的释放和聚集，从而减轻气道炎症。

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