柯长洪

摘 要：随着纳米技术与生物医学的发展，纳米材料用于核酸药物递送具有广泛的应用前景。核酸分子（质粒DNA、反义寡核苷酸和小分子干扰RNA）在细胞中以可控的方式进行表达，其在未来疾病的治疗和机制研究中起着非常重要的作用，包括基因治疗，基因疫苗以及小分子干扰RNA对细胞功能及信号干扰的研究。然而， 由于核酸药物自身负电荷性与带负电荷的细胞膜产生排斥作用，游离核酸很难进入到靶细胞中发挥作用。基于纳米材料携带核酸递送主要瓶颈在于既能高效、特异性的将核酸药物递送到靶细胞中同时又不会对机体产生毒副作用和引起免疫原性。本综述对近年来用于核酸药物递送所面临的挑战和阳离子脂质体的设计原则及其应用进行阐述。同时对开发新的阳离子脂质体用于临床核酸药物递送提供一定的借鉴。

关键词：核酸递送；阳离子脂质体；纳米材料；非病毒载体

1、前 言

本文对核酸递送过程中所面临的障碍以及阳离子脂质体结构特征包括亲水性头、疏水性尾以及两者之间的链接键linker对细胞转染影响和细胞毒性进行综述，为合成新的阳离子脂质体在体内外用于核酸递送提供一定借鉴意义。

2. 核酸治疗中主要障碍

2.1细胞外递送（Extracellular delivery）

纳米载体包裹核酸药物递送到病灶部位进行靶向治疗，能够避免裸核酸（DNA/RNA）在血液循环过程中被酶水解，提高基因治疗效果。外源性物质进入机体后，很容易受到由单核巨噬细胞组成的网状内皮系统（RES）排出体外。

2.2 细胞摄取（Cell Targeting and uptake ）

核酸药物只有在细胞内才能有效地发挥作用，包裹核酸药物的纳米粒子即使成功逃脱网状内皮细胞捕获而未能将药物分子传输到细胞内，同样很难取得比较好的治疗效果。细胞对纳米粒子的吸收主要通过网格蛋白、小窝蛋白介导的胞饮，巨胞饮和吞噬作用和网格/小窝非依赖性的内吞。

2.3 内涵体释放（endosome release）

外源性物质通过内吞方式进入细胞，与细胞膜表面相关的蛋白进行融合依次形成初级内涵体、早期内涵体、晚期内涵体、自噬体以及自噬溶酶体等。一旦携带有核酸的纳米粒子通过内吞进入自噬溶酶体后，在溶酶体内低pH值和各种蛋白水解酶作用下，核酸就会被降解排出体外从而使核酸药物失效。

3. 纳米工程化阳离子脂质体用于核酸药物递送

基于纳米材料包裹核酸药物递送所存在的以上障碍，能够用于细胞内核酸递送的纳米材料必须具备以下优势：第一，能够保护核酸药物免于核酸酶的降解；第二，有助于核酸跨过细胞膜后能够顺利从早期内涵体中逃离出来进入到细胞质和细胞核中；第三，具有良好的生物相容性，对细胞和机体毒副作用低；第四，在血液中能够长效循环而不被网状内皮细胞捕获从而提高药物的利用度；第五，靶向性强，避免非特异性吸附以及为了达到治疗效果而提高的药物浓度所产生的细胞毒副作用。

3.1 亲水性头阳离子脂质体对细胞转染影响

相对病毒载体而言，非病毒载体最大的不足就是转染效率低，为了尽可能提高阳离子作为基因载体的转染效率，目前普遍采用的是季铵盐阳离子亲水性头，因为其在任何溶液pH值环境下均带正电荷能够促进细胞对阳离子脂质体的内吞。有研究表明，在亲水性季铵盐头上用带羟基的烷基取代原来的甲基之后，其转染效率显著增强达到甚至超过市售lipo2000的转染效率。另外，有研究表明在季铵盐头上引入两个甚至三个羟基烷基头不仅有助于提高脂质体的转染效率，同时由于引入更强亲水性基团导致的细胞毒性会降低。

3.2 疏水性尾對细胞转染影响

作为阳离子脂质体另一个重要组成部分疏水性链，其结构影响着脂质体相转变温度、与中性脂质体DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）形成纳米脂质体双层膜流动性及稳定性、DNA免于酶的降解、内涵体的逃逸、DNA的释放和核膜的穿透，还有细胞毒性等，而所有这些因素都会直接决定合成的阳离子脂质体能否用于核酸递送，转染效率有多高以及目的基因最终表达水平。因此，对疏水链的链长、疏水链的数目、链的种类（脂肪链和类固醇链），链的饱和度如何影响细胞转染进行了讨论。

脂肪链中含有的不饱和键对转染效果有着显著影响。Koynova合成了两种阳离子脂质体用于DNA递送，这种脂质体区别在于一个是使用带有不饱和键的的油酸作为疏水链，而另一种则是含有饱和烃的硬脂酸作为疏水链，结果发现，含有油酸的阳离子脂质体递送DNA能力显著优于硬脂酸阳离子脂质体。不饱和脂肪链阳离子脂质体不足之处就在于稳定性比较差，含有的不饱和键容易被氧化而不能长期保存。

3.3 链接亲水性头和疏水性尾巴linker对细胞转染影响

在所有阳离子脂质体中连接亲水性头和疏水链尾的链接键几乎都包含了醚键、酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键以及二硫键。这些链接键主要是通过影响阳离子脂质体对细胞和组织的生物毒性，从而降低阳离子脂质体对靶细胞和组织的转染效果。例如含有醚键的DOTMA（N-1-（2，3-二油酰氧基）丙基-N，N，N-三甲基氯化铵）虽然转染效率比较高，但是由于脂质体中含有的醚键难以降解对细胞的毒性比较大；而将其中的醚键换成酯键后的DOTAP（（2，3-二油酰基-丙基）三甲基氯化铵），在不改变转染效率的前提下降低了对细胞的毒性。Ilies合成了两种带吡啶头的阳离子脂质体，一种是以酰胺键作为linke，另一种是以酯键作为linker来比较这两种脂质体对细胞转染的影响。结果表明，相对于酯键，酰胺键较高熔点和较低的相转变温度导致其化学稳定性更强，因而转染效率高；而由于酯键的相对不稳定因而细胞毒性更低。为了兼顾酯键的低细胞毒性和酰胺键的高转染效率，近年来，人们对基于氨基甲酸酯作为linker的阳离子脂质体研究也越来越重视。由于氨基甲酸酯在中性环境下如正常生理环境（pH 7.4）能够稳定存在，而一旦溶液的pH值降低（如在内涵体中pH 5～6）就会酸性催化水解从而将包裹的核酸药物释放出来，同时脂质体自身被水解成没有毒性的小分子排出体外。谷胱甘肽（GSH）——含有巯基的肽，其在细胞质中的浓度是血浆的 500-1000 倍左右，这也为设计含有二硫键的阳离子脂质体用于核酸递送提供思路36。其它具有光敏感和pH敏感的linker阳离子脂质体也被开发用于核酸递送。

综上所述，作为阳离子脂质体三个重要组成部分的亲水性头、疏水性尾和中间的链接键linker，每个部分在核酸递送中都起着至关重要的作用，但是这三者并不是独立的，而是相辅相存。因此在设计开发新的阳离子脂质体时，应该从以下几个方面进行考虑：第一，DNA和RNA的压缩程度；第二，尽可能通过增强阳离子脂质体与细胞膜之间的相互作用促进纳米载体的内吞；第三，膜的融合能力既能有利于纳米脂质体通过细胞质膜进入细胞质，同时有利于从内涵体中逃逸出来避免进入溶酶体被降解；第四，设计合成的阳离子脂质体细胞毒性更低，生物相容性更好。